细胞培养标本FISH玻片处理4.0

试剂准备：（mm2.1:H2O:cot-1=7：2：1）

   1、蛋白酶K  25ml

    A、 10%SDS            120ul     96        86.4

    B、 蛋白酶K   20mg/ml     250ul     200        180

    C、 PBS       补齐至    25ml      20ml       18ml

2、PBS：PH7.0      3、二甲苯        4、100% 、 85%  、75% 的酒精     

5、甲醇：乙酸=3：1

6、变性液 ： 35ml 甲酰胺， 5ml  20*SSC (PH=7.0),  10ul  0.5M EDTA  pH=7.0， 10ml 单蒸水，最后50ml pH=7.0-7.5     4℃保存，1个月使用有效。

7、20*SSC                   8、洗液：2*SSC  含 0.1% 吐温-20   9、秋水酰素：10ug/ml

     9、甲醇：乙酸=3：1

预处理：

1.   培养细胞长到融合率70%-90%时候，加入25ul秋碱/5ml培养基，继续培养30分钟到2小时（依据细胞生长率不同和细胞系特性，调整时间）。

2.   胰酶消化细胞。

3.   预热 0.075 KCl 在37ºC 水浴箱。

4.   5ml预热的0.075M KCl,大力吹打。37℃孵育10-30分钟。;

5.   预固定：加2ml固定液，轻轻吹打。固定10分钟。离心1000rpm，10分钟。丢弃上清，再同样5ml固定，离心2次。

6.   去掉上清，留下上清液的量使得细胞保持在牛奶状细胞团，一般是0.5-1mL .如果滴片，请立即滴片。在适当高度滴片（10-30cm）。如果不用，不去除最后一次上清。1-2天用放2-8℃，如果长时间不用冷冻起来。

7.   老化：染色体片子，37℃老化1-7天。用前60摄氏度，加热3-4小时。

8.   变性液：74℃±1水浴平衡至少30分钟或用杂交仪。（注意温度：容器内和实际温度），将玻片浸入2-5分钟，依据玻片的制备时间每增加一周，时间增加2分钟。

9.   梯度脱水：马上置入冰冷70%酒精3分钟，然后85%、100%酒精脱水，各1分钟。用前放置到37-45摄氏度备用。

 

探针变性：

1、77℃变性5分钟，37℃平衡2分钟，建议用PCR仪。

2、将探针加在完全干燥的玻片上。（注意避光）

3、加盖玻片，Rubber 胶封片。过夜（12-18小时）。

 

玻片洗涤：

1，   准备2缸洗液。1缸置于72℃，至少30分钟。

2，   轻轻揭去玻片上的胶，如果不好揭开以及为避免干燥，可以先放在常温洗液里面。

3，   72℃缸，洗涤2分钟；常温缸，洗涤2分钟。

4，   脱水，75%、85%、100%酒精，1分钟。空气干燥。  

观察结果：

1、  加DAPI 20ul复染，加盖玻片。

2、  置于暗处20分钟，显微镜观察结果。

3、结果，镜下观察需要考虑滤光片和显微镜调节，请仔细观察。（有些荧光眼睛看不到，需借助显微镜）

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