常见问题-广州市外显子生物技术有限公司

想在贵公司合成miRNA或mRNA FISH探针，需要提供那些信息？

需要提供的信息：① 种属（Human, Mouse, Rat, Rabbit等）；② 基因名称，未知的基因需要提供序列；

mRNA或miRNA探针的价格是多少，能检测多少片子，标记探针的周期？都包括那些内容，是否包含阴性对照、FISH杂交液等辅助组分？

mRNA或miRNA探针价格2800元，体积是50μl，和杂交液按1：50-100稀释，能检测100-200张片子。 mRNA或miRNA探针的备货周期，自客户确认下订单日起计，2周内发货。 mRNA或miRNA包括了1ml FISH RNA 杂交液、1ml DAPI-抗荧光淬灭封片剂、50μl阴性对照或阳性对照探针(阴性、阳性对照只能选一种)。

贵公司合成的mRNA探针，是cDNA探针，还是cRNA探针，长度大概多少？

我们合成的mRNA探针属于cRNA探针，长度40－600bp。

检测的标准收费；检测没有结果，如何收费？

miRNA和mRNA的检测费用相同：每个标本1800元/标本，不包含目的探针的费用，但包含对照U6 （miRNA）或GAPDH （mRNA）的内参探针费用和检测费用，拍照及结果统计。如果阳性对照有结果，无论miRNA或mRNA是否有结果，均正常收费，如果对照U6没有结果，不收检测费。

DNA FISH探针收费，如何保证质量？

每个目的基因探针3600元，15T，对照探针3600元，15T，赠送DAPI-抗荧光淬灭封片剂（封片的同时，减缓荧光淬灭），另本公司还提供专门针对DNA FISH的检测试剂盒。探针标记之后，我们都会进行中期染色体质检，质量过关才发货。

检测miRNA或mRNA标本的收集、处理与保存

石蜡切片：石蜡块或石蜡切片保存时间不超过5年的标本可以检测miRNA，不超过半年的标本可以检测mRNA。收集标本后，请立即用10%中性福尔马林浸泡，固定24小时后，石蜡包埋切片。收集到标本后，最好立即固定，然后切片，不要将标本储存在-80℃，-80℃储存后影响实验结果。冰冻切片：取标本后，立即-80℃冰冻，如果不能马上切片，-80℃保存，干冰运输。冰冻切片保存时间不超过2年的标本可以检测miRNA 或mRNA。

如何用FISH定位某个基因？

例如：需要检测两个目的基因，例如MLAA-34及MLAA-22，能用FISH做这个两个基因的染色体定位吗？如果是检测这两个基因在哪几号染色体的哪个区段，2个（探针）混合在一起检测，能达到效果吗？对于已知基因，想定位某个基因在哪几号染色体上，通过“目的基因探针和染色体对照探针”结合起来，才能实现，单纯地用使用某个目的基因探针，是不能定位的。对于未知基因，由于不知道使用哪个染色体的对照探针，所以只能靠Gimsa染色后，再做FISH。“Gimsa+FISH”检测周期至少1个月。

想针对一个1000bp左右的片段设计DNA探针，单拷贝的，可行吗？

片段比较小，直接荧光标记（FITC，Texas Red、Rhodamin）探针很难检测出来。可以用地高辛标记的探针，荧光信息放大系统（ABC或TSA放大系统）尝试一下，但是不保证能检测到，文献报道过检测到的最短的片段是780bp。

探针的用量是否与涂片的浓度有关？比如，一张玻片上一千个细胞，另一张是一百个细胞，探针用量一样吗？

与细胞数量的关系不大，一般20mm×20mm玻片面积（盖玻片），5-10μl探针已经足够。探针的用量一般取决于标本面积的大小和所使用的盖玻片的大小，使用20mm×20mm的盖玻片，加5-10μl探针，使用20mm×40mm的盖玻片，加10-20μl探针。

检测某个融合基因，荧光定量或FISH方法，哪种好一点。

如果是已知的位点，可以做RT-PCR；如果是未知位点，则要用FISH检测； RT-PCR检测的费用较低，FISH费用比较昂贵。

贵公司生物的DNA FISH探针对标本有什么要求，制备好中期染色体涂片的R显带可以吗？到时可不可以一起杂交？

我们公司生产的探针适用于中期染色体滴片、细胞爬片、石蜡切片、可以R显带，但是R显带制备比较难，制备G显带的多一些（G显带每标本1000元）。但是R带与FISH结合的概率很小，所以做起来有一定的难度。

检测某基因的拷贝数，是不是只能通过FISH检测，RT-PCR能检测吗？

RT-PCR不能检测某基因的拷贝数或者是否扩增，它检测的是基因表达的相对高低。检测某个基因的拷贝数，只能通过FISH检测。

细胞本身带GFP绿色荧光，使用地高辛标记miRNA的探针，抗地高辛的罗丹明荧光二抗，还有DAPI，细胞本身带GFP绿色荧光会不会对荧光二抗和DAPI的显色产生影响？

不会影响荧光二抗和DAPI的显色（DAPI是蓝色，GFP是绿色，罗丹明荧光二抗是红色的）,但是容易串色。

观察DAPI的荧光应使用哪种滤光片，会不会和GFP重叠？

观察DAPI应该使用紫外滤光片或者波长在300～400nm的都可以（激发波长和发射波长），一般荧光显微镜都有。有可能串色，但是影响不大。我们实验室曾做过，细胞自身带GFP绿色荧光和红色荧光的FISH。

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