纳米金颗粒标记核酸探针特异性检测细菌的实习报告
学生姓名:王瑞晨 学校:齐鲁理工学院 实习单位:外显子生物实验室
报告日期：2024年8月1日至8月30日
1. 实验目的
利用金纳米颗粒标记寡核苷酸探针特异性检测细菌。
2. 研究背景
2.1 纳米金颗粒的特性
金（Au）是一种化学性质稳定且被广泛认知的贵金属，具备良好的导电性能和导热性能。金在纳米级别时展现出独特的光学特性，这些特性主要包括其表面等离子体共振（Surface Plasmon Resonance, SPR）效应[1]。独特的光学特性指的是金纳米颗粒在特定波长的光照射下表现出的特殊光学行为，这些行为与其形状、尺寸大小和周围环境的光学性质密切相关[2]。此外，表面等离子体共振效应是指金纳米颗粒表面的自由电子在与光场相互作用时发生的集体振荡，形成强烈的光吸收和散射现象。等离子体共振是由于金属纳米颗粒的电子云在光的作用下发生共振，导致其对特定波长光的吸收和散射显著增强，其在提高检测灵敏度上有显著的提升[3]。
金纳米颗粒的光学特征，如显著的光散射、极化激元模式等[4]，这些显著的光学特性让其在生物成像和传感器领域拥有广泛的应用[5]。其中，光散射指的是光线被金纳米颗粒偏转或反射的现象，而光吸收则是指光线的能量被颗粒吸收并转化为其他形式的能量。这些特性使金纳米颗粒在探测和成像中极具优势。
此外 ，金的化学稳定性及生物相容性使其在生物标记和诊断中十分出色[6、7、8]。同时，金纳米颗粒可以形成稳定的金属键，这对于颗粒的功能化是至关重要的[9、10、11]，金还可以与特定的核酸序列结合，如AAAA等序列。颗粒的功能化包括对金纳米颗粒进行化学修饰，以实现特定的生物标记功能。金纳米颗粒的大小和形状对其功能化的效果有显著影响。如球形金纳米颗粒通常具有均匀的光学特性，适用于广泛的生物成像应用，而纳米棒状或纳米星状颗粒则可以通过调整其尺寸和形状实现对不同波长光的特异性响应。这些特征使得金纳米颗粒在生物医学领域的应用更加精准和多样化。
2.2 核酸的特性
核酸是由核苷酸单元构成的长链聚合物，分为脱氧核糖核酸（DNA）和核糖核酸（RNA）。DNA通常呈双链结构，氢键稳定其双螺旋构型，而RNA则通常为单链，在某些区域可能形成局部的二级结构（如发夹结构）。核酸在生命过程中发挥核心作用，负责携带遗传信息并参与基因表达调控。核酸分子由于其磷酸骨架中的磷酸根离子(PO43-)而带有负电荷。这一特性赋予核酸独特的溶解性，并使其可与其他带正电的分子发生相互作用。相较于单链DNA，双链DNA具有更高的稳定性，而RNA的结构则展现出更大的灵活性，使其能够承担多样的生物功能。核酸的来源可以使提取DNA或PCR产物或合成的寡核苷酸。
2.3 金与核酸的结合
金纳米颗粒与核酸的结合可以通过多种方式实现。最常用的方法是通过金颗粒表面与核酸中的巯基修饰寡核苷酸结合。这些巯基化合物（如硫醇）与金之间存在着强烈的化学亲和力，能够在金颗粒表面形成稳定的自组装单层（Self-Assembled Monolayers, SAMs）。除了巯基外，其他化合物，如胺基（-NH2）[12]、磷酸基团（-PO4）[13]、双硫键（-S-S-）[14]和聚乙二醇（PEG）[15]等，也可用于与金纳米颗粒结合。通过这些化学修饰，目标核酸可以有效地固定在金纳米颗粒的表面，从而实现金纳米颗粒与核酸的高效连接。
2.4 金纳米标记的核酸探针的应用
考虑金纳米标记核酸探针的独特光学和生物学特性，其在生物传感、疾病诊断等领域展现出巨大的应用潜力。这些探针可以被用来标记特定的细胞或微生物，以研究其在生物体内的分布情况。例如，在细菌标记方面，金纳米标记的核酸探针能够特异性识别细菌表面的特定核酸序列，这有助于科研人员追踪细菌在组织中的位置。此外，这些探针还能够用于检测环境样本中的病原微生物，提升检测的灵敏度和特异性。但是，金纳米标记的核酸探针在应用中仍然具有一些不足之处。首先是灵敏度的限制，金纳米标记的核酸探针在检测低浓度时，往往会因为受背景信号的干扰导致检测不准确[16]。另外长期使用金纳米颗粒标记的核酸探针也可能带来生物安全的问题。研究者做的关于表面电荷对聚乙二醇修饰金纳米离子生物行为的影响中也提到了PEG修饰的AuNPs具有较低的生物毒性[17]。这意味着金纳米颗粒与核酸的结合应用越来越多，然而需要标记出较好金核酸并非容易，需要优化各种条件，才能获得好的实验结果，发挥诊断应用、传感技术的应用。
3. 实验原理
本实验利用金纳米颗粒的光学特性及金纳米标记核酸探针对大肠杆菌DNA序列的特异性识别。首先，将巯基修饰核酸与金纳米颗粒结合，然后利用该探针标记大肠杆菌，进而观察其分布。在电子显微镜观察下，由于金纳米探针具有高电子密度，会产生明显的亮点，这为我们直接记录大肠杆菌上金纳米探针的分布及数量提供了基础。
4. 材料和方法
4.1 材料与试剂
氯化金水溶液（1 mM），柠檬酸三钠溶液（0.921M），细菌16S纳米金SH探针 NNNNNNNN，EUB338纳米金SH探针。，ddH2O（用于重新悬浮金纳米颗粒）
大肠杆菌EUB338：5’-GCTGCCTCCCGTAGG-3’.PBS缓冲液
4.2 实验步骤
4.2.1 制备金纳米颗粒
配制1mM浓度的氯化金水溶液，将氯化金溶液加热至沸腾。迅速加入适量的还原剂（柠檬酸三钠溶液，0.921M），并继续加热搅拌。待溶液颜色变为深红色后，停止加热并自然冷却至室温。
4.2.2 硫醇修饰核酸探针的结合
核酸探针溶液的制备：先将核酸探针以1000转离心1min，然后在细菌16S SH核酸探针加入100µL的ddH2O，在EUB338纳米金SH加入122µL，配置成100µM。分别将20µL硫醇修饰的核酸探针溶液加入到含有400µL的金纳米颗粒溶液的玻璃试管中。在微波炉中以中低火加热3min，加热后溶液出现粉红色。确保核酸探针充分结合到金纳米颗粒表面。恢复室温后，将溶液转入离心管中，在15℃、12000转、离心20min。通过离心分离未结合的核酸探针。离心完后观察到底部出现红色沉淀，去除上清，在沉淀中加入200µLddH2O重新悬浮金纳米颗粒。
4.2.3 探针与大肠杆菌的结合
1.将大肠杆菌重悬于适量的生理盐水或PBS缓冲液中。
2.采用消化法、盐酸处理方、打孔的方法增加细胞膜的渗透性。
3.将处理好的大肠杆菌与金纳米颗粒标记的核酸探针混合均匀。
4.在37°C孵育一段时间（60分钟），促进探针与细菌的结合。
4.2.4 观察与检测
使用奥林巴斯显微镜，最好是电子显微镜观察标记的金纳米颗粒的细菌，但是是否结合到大肠杆菌上需要用电子显微镜观察。
5实验结果
5.1氯化金（AuCI3）溶液的制备
实验中我们使用1g的氯化金（如下图1所示）配置成1.43mol/L的氯化金溶液（如下图1所示）制备中氯化金固体颗粒呈现黄色透明小颗粒，制备完后的氯化金溶液呈现淡黄色。
图1
5.2胶体金溶液制备前的准备
5.2.1 1mM氯化金溶液的制备
通过吸取70µ L的氯化金溶液（浓度为1.43mol/L）加入到塑料瓶中，而后在量取336ml的蒸馏水，加入到塑料瓶中，搅拌混合成1mM的氯化金溶液。
5.2.2 柠檬酸三钠溶液的制备
称取23.5g的柠檬酸钠，倒入到塑料瓶中，并加入100mL蒸馏水，摇匀，配置成0.921M的柠檬酸三钠溶液（如下图2所示）。[18]
图2
5.3胶体金溶液的制备
将装有氯化金的塑料瓶进行水浴加热，水开后加热5分钟后迅速加入柠檬酸三钠溶液，并持续用玻璃棒进行搅拌，待溶液呈现深红色（如下图3所示）后停止搅拌，并冷却至室温。
图3
5.3 胶体金与核酸探针混合以后的图像
5.3.1胶体金溶液与核酸探针混合离心以后如下图所示
（上图为第一次胶体金与核酸探针混合离心完后的图像，其中左图为EUB338纳米金SH探针与胶体金溶液结合离心后的图像，右图为细菌16S纳米金SH探针与胶体金溶液结合离心后的图像）
（上图为第二次胶体金与核酸探针混合离心完后的图像，其中左图为EUB338纳米金SH探针与胶体金溶液结合离心后的图像，右图为细菌16S纳米金SH探针与胶体金溶液结合离心后的图像）
（上图为第三次胶体金与核酸探针混合离心完后的图像，其中左边离心管为EUB338纳米金SH探针与胶体金溶液结合离心后的图像，右边离心管为细菌16S纳米金SH探针与胶体金溶液结合离心后的图像）
5.3.2实验显示三次独立的重复实验，实验结果基本一致
在本实验中，为了验证金纳米颗粒与核酸探针结合成功的可靠性，我们对关键实验步骤即核酸探针与纳米金颗粒的结合，进行了三次独立重复实验。实验结果如下表格所示，两次实验均使用了相同的样本、试剂和实验条件。实验结果表明，在三次独立重复实验中，观察到基本一致的结果。
实验结果
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编号 |
内容物 |
结果（实验一） |
结果（实验二） |
结果（实验三） |
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1 |
超纯水2.5µ L |
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2 |
细菌16S纳米金SH探针与胶体金溶液微波加热离心完后上清液2.5µ L |
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3 |
细菌16S纳米金SH探针与胶体金溶液微波加热离心完后沉淀2.5µ L |
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4 |
EUB338纳米金SH探针与胶体金溶液微波加热离心完后上清液2.5µL |
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5 |
EUB338纳米金SH探针与胶体金溶液微波加热离心完后沉淀2.5µ L |
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5.4胶体金溶液与氯化金溶液颜色的不同与金不同的化学状态有关
实验中，我们发现胶体金溶液呈现粉红色，而氯化金溶液呈现黄色。这一颜色差异主要与金纳米颗粒的直径大小有关。具体来说，金纳米颗粒的直径大小直接影响其光学特性。当金纳米颗粒的直径在10-100纳米范围内时，它们能够显著吸收蓝色光并散射红色光，从而在溶液中表现为粉红色[19] 。相反，氯化金溶液中的金离子直径较小，通常不形成纳米颗粒，因此在溶液中主要吸收绿色光并反射黄色光，从而呈现黄色 。这种颜色差异可以归因于金纳米颗粒的尺寸效应，影响了其光的吸收和散射特性 。
6讨论
6.1金纳米颗粒与核酸之间的相互作用
在本实验中，我们分析了金纳米颗粒与核酸之间的相互作用。理论上，金纳米颗粒与核酸之间不会发生缠绕现象。金纳米颗粒通过化学修饰与核酸结合，形成稳定的复合物，该结合主要依靠金表面的巯基化合物与核酸的连接，而非缠绕。缠绕现象一般退化在高浓度或特定条件下的分子间相互作用，而金纳米颗粒的结合则是通过稳定的化学键实现的[20]。而在本实验中我们借鉴了周小明课题组球形核酸探针构建新技术[21]中通过微波炉加热的方法，通过微波加热促进金纳米颗粒与核酸探针之间的结合，从而减少纠缠现象发生的可能，然而是否制备的金纳米与核酸探针结合时会发生缠绕现象，本实验中我们并没设计相关实验进行验证，后续有待进一步实验的验证。
6.2金纳米颗粒的形状及大小对其在生物标记中的应用具有重要影响
金纳米颗粒的形状和尺寸多样，包括球形、棒状、星型和片状等。其中，球形金纳米颗粒被认为是最佳选择，因为其均匀的光学特性与稳定的化学性质使其在生物探针中表现出良好的灵敏度和特异性。球形颗粒的表面修饰相对简便，能够有效与巯基修饰的核酸结合[22]，因此适合用于金纳米标记核酸探针的实验。
6.3核酸探针是否与金成功的结合
在三次实验中通过紫外-可见光谱图我们并不能知道核酸探针与金是否成功的结合？而核酸探针与胶体金混合的溶液加NaOH后，OH-会破坏金与核酸探针的结合，核酸探针会剥离，而我们知道核酸在检测中在260nm出会有波峰出现（如下图4所示）。所以我们设计实验，通过给第二次实验中细菌16S纳米金SH与胶体金溶液混合离心完后的上清液和沉淀中，分别加入NaOH。通过加入前与加入后260nm的变化来判断金纳米是否与核酸探针结合。但通过观察图像（如下图5所示）我们发现其前后并没有太大的变化，其进一步证明有待后续实验的验证。但是，胶体金与核酸探针结合，在三次测量中发现在离心完的上清和沉淀中都没有核酸所特有的在260nm处的波峰，即没有测量出核酸。所以我们有理由推测胶体金包裹住了核酸探针，因为测量时我们通过SMA4000紫外分光光度计发射特定波长的光源对代测液体进行测量，而金纳米颗粒具有良好的光学性质，所以在测量时可能反射掉了检测的光波，导致在上清液和沉淀中都没有检测出核酸。
细菌16S纳米金SH EUB338纳米金SH
图4
上清液 上清液+NaOH
沉淀 沉淀+NaOH
图5
6.4胶体金溶液的pH是否影响金颗粒与核酸探针的结合
通过加入NaOH后发现前后图像并没有太大的变化，所以我们猜想是否是胶体金溶液的pH值影响了核酸探针与金颗粒的结合。所以我们通过滴加胶体金溶液到pH试纸，通过比色卡进行比色，发现其pH大概在7左右，为中性。所以可以证明并不是胶体金溶液的酸碱性对实验结果产生的影响。
6.5胶体金颗粒直径的大小对其紫外-可见光谱中波峰位置的影响
在前面测量其波长和pH后，我们怀疑是否是氯化金溶液不纯，导致测量结果不能直观反应金颗粒与核酸探针是否成功结合。所以我们测量了高浓度的氯化金，发现其在290-300nm处有一个波峰（如下图6所示）而这与周小明课题组所提到500-550nm处有波峰不一致。而通过《金纳米粒子的制备及其光学性质》的文章[23]我们知道金纳米粒子直径越大，其溶液吸收光的波长越向长波方向移动，而本实验中我们所制备的纳米金颗粒为10nm左右，而周小明课题组制备的则是30-40nm的纳米金颗粒。所以这就解释了本实验图像的波峰位置为什么在290-300nm处。
图6
6.6胶体金溶液加热后仍然保持粉红色并没有变为无色
在周小明课题组的实验中，胶体金溶液在加热过后溶液变为无色。（如下图7A所示）而在本次实验中，我们微波加热了胶体金溶液，发现其仍然保持粉色（如下图7B、7C所示），这可能是因为加热时长和温度不够，或是与胶体金大小分布有关，进一步的研究有待后续实验的验证。
6.7浓的氯化金溶液有波峰而制备低浓度的胶体金溶液没有波峰
在实验中我们分别测量了氯化金溶液的紫外-可见光谱图和胶体金溶液的紫外-可见光谱图结果图像差异明显（如下图8所示），我们推测这可能与溶液中离子的浓度和分散状态有关。需进一步设计实验进行验证。
氯化金溶液的图像 胶体金溶液的图像
图8
6.8延长微波加热时间、加入TCEP对核酸探针与胶体金颗粒结合的影响
上述三次实验后我们发现图像始终不能很好的表达核酸探针是否与金颗粒结合，所以我们推测是不是核酸探针与金结合率不高导致的，可能是因为标记有SH基团的核酸探针中SH之间发生了偶联，影响了核酸探针与金的结合。所以我们设计了加入还原剂TCEP，实验中我们现在核酸探针中加入等体积的TCEP，在38℃培育40分钟，通过TCEP还原二硫键来增加核探针与金表面结合疏基的数量，然后加入胶体金溶液重复上述实验步骤。结果发现EUB338纳米金SH上清液和细菌16S纳米金SH上清液相较于不加TCEP图像没有明显的变化（如下图9所示），因此推测核酸探针与金颗粒结合在图像中表达不明显可能与核酸探针自身形成巯基偶联关系不大。
TCEP+细菌16S纳米金SH上清液 细菌16S纳米金SH上清液
TCEP+EUB338纳米金SH上清液 EUB338纳米金SH上清液
图9
参考文献
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