EB病毒原位杂交检测试剂盒
一、试剂盒介绍：货号：EB-1803
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试剂1 |
玻片处理液A |
50毫升 |
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试剂2 |
生物素标记的EB探针杂交液 |
5毫升 |
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试剂3 |
HRP标记的抗生物素抗体溶液 |
5毫升 |
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试剂4A |
DAB显色液A液 |
0.5毫升 |
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试剂4B |
DAB显色液B液 |
0.5毫升 |
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试剂5 |
蛋白酶K缓冲液 |
50毫升 |
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试剂6 |
PBS缓冲液 |
1000毫升×2袋 |
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试剂7 |
2xSSC缓冲液 |
1000毫升×4袋 |
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试剂8 |
苏木素染液 |
50毫升 |
（1）检测原理：
EB病毒属DNA类的疱疹科病毒，能特异性嗜淋巴细胞。通过接触传播，将侵入鼻咽部的淋巴样组织或其他肿瘤组织内部。主要侵犯的是B淋巴细胞。EB病毒在自然界广泛存在，与鼻咽癌发病密切相关、还肠道肿瘤以及传染性单核细胞增多症有关，此外还和淋巴瘤发病密切相关，如霍奇金淋巴瘤，Burkitt淋巴瘤等、慢性疲劳综合征、器官移植等。
EBER是EB病毒编码的小RNA，在EB病毒感染的细胞核内出现。对EBER进行克隆、合成标记的EBER RNA探针，可用于冰冻切片、石蜡切片、细胞涂片、细胞爬片，具有较高的特异性和灵敏度。
（2）试剂盒特点：
本试剂盒采用生物素标记探针，辣根过氧化物酶系统DAB显色剂，敏感性强；蛋白酶K消化，稳定可靠；37℃杂交即可；常温PBS洗涤；一步检测。
（3）试剂盒成份：
（4）保存条件
Ø 所有试剂2-6℃保存;
Ø 试剂盒在有效期内的稳定;
Ø 不要使用已经过期的试剂;
Ø 用前，将所有的试剂恢复至室温（20-25℃），探针溶液必须混匀;
Ø 应带手套操作，使用新鲜二甲苯及乙醇溶液。
二、 检测预准备
l DAB显色液：将试剂4A：4B：PBS按体积比1:1:18的比例混合，按实际需要量配制，即配即用。
l PBS配制：将一袋PBS粉末溶于1000毫升双蒸水，彻底溶解，混匀后使用。
l SSC缓冲液：将一袋SSC粉末溶于1000毫升双蒸水，溶解，混匀后使用。
三、 检测步骤
1． 烤片：将组织切片置于烤箱或加热板，在85℃的温度下加热20分钟。.
2． 脱蜡：把加热后的组织切片浸泡在二甲苯溶液中，五分钟一次，总计三次。再将组织切片依次放入梯度乙醇100%、85%和75%中，每次3分钟。用蒸馏水洗涤2分钟。
3． 再用，3%的双氧水浸泡组织切片15-25分钟，用蒸馏水洗涤2分钟。
4． 在组织切片或细胞上滴加200-300μl 玻片处理液，在常温下浸泡20分钟，用PBS洗涤5分钟。
5． 每一个载玻片上滴加200-300μl 蛋白酶K缓冲液，使之覆盖细胞，放入湿盒中，在37℃的干燥箱中培养15分钟，用PBS洗涤3次，每次5分钟。
6． 每一个组织切片上滴加30-50μl的含有生物素标记的EB探针的杂交液，盖上盖玻片，在95℃的加热板上加热5min，再放入湿盒中，在37℃的干燥箱中放置至少16h。
7． 取出湿盒中的组织切片，用2xSSC溶液洗涤15 min。
8． 在组织切片中加入30-50μl/片的HRP标记的抗生物素抗体的溶液，常温下孵育1小时，用2xSSC洗涤15分钟。
9． 加适量配制好的DAB显色液，显色5-15分钟，注意光镜下观察显色情况。用蒸馏水冲洗1分钟。
10． 滴加适量苏木素复染，染色约1min，用蒸馏水或去离子水短时间冲洗，浸泡PBS 10分钟返蓝。
11． 封片：依次放入梯度乙醇溶液（75%、85%、100%）中各3min，再放入二甲苯溶液中，10分钟。滴加中性树脂，盖盖玻片，常温保存。两年内不褪色。
四、 结果评判：
（1）阳性结果出现在细胞核上，颜色显示深棕色或浅棕色，与EB含量有关，阴性结果是核上无棕色。
（2）细胞浆，红细胞染色是非特异的，因为部分血液细胞、红细胞、内分泌细胞存在内源性酶或生物素。
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