（1）外显子生物实验室提供： Pull down RNA探针标记服务；价格：3500元，10-20T，备注：小于2000bp。
（2）提供：RNA标记生物素，以便于开展Pull down实验。
（3）标记原理：通过T3、T7转录获得互补的RNA，然后，进行3端标记，将生物素标记在RNA上；
（4）获得的RNA探针，用于Pown down实验。
附说明书：
磁珠法RNA-Protein Pull-Down 试剂盒（V5.3）
货号：R5126 本试剂盒室温运输，储存于4°C
试剂盒成份：
（一）蛋白-RNA富集试剂盒（25T） R5126-1，储存于4°C
（1）Streptavidin 磁珠：1mL, 10mg/mL；
（2）RNA捕获溶液：10mL, 20mM Tris pH 7.5, 1M NaCl, 1mM EDTA
（3）20mM Tris, 5mL, pH 7.5
（4）蛋白-RNA结合溶液(10X)：1mL,0.2M Tris pH 7.5, 0.5M NaCl, 20mM MgCl2, 1% Tween-20
（5）洗液(1X), 10mL, 20mM Tris (pH 7.5), 10mM NaCl, 0.1% Tween-20
（6）Biotin Elution Buffer, 1.5mL
（7）50%无菌甘油, 0.5mL
（8）HuR Monoclonal Antibody, 50μL, For Western blots（10T）
（二）探针对照：R5126-2，储存于-20°C
Positive AR RNA Probe：10μM， 25μL, 5Test。
5´-CUGGGCUUUUUUUUUCUCUUUCUCUCCUUUCUUUUUCUUCUUCCCUCCCUA-3´
Negative RNA (A)25 Probe： 25μL, 5Test。
试剂盒介绍：
磁珠法RNA-蛋白质沉淀试剂盒，利用链霉亲和素磁珠链接到生物素标记的RNA，形成磁珠探针，生物素标记的RNA探针与目的蛋白（RBP）结合。磁珠-亲和素-生物素化RNA与蛋白形成复合物。通过磁珠分离出来。该试剂盒包括：各种缓冲液，标记生物的阳性对照、阴性对照，适合下游检测如蛋白质印迹（WB）和质谱（MS）。
对照原理：阳性RNA对照系统：利用3'非翻译区雄激素受体（AR）RNA，AR RNA的近端3´非翻译区（UTR）包含HuR和Poly（C）结合蛋白（CP1和CP2）的UC富集区。这些RNA结合蛋白调节mRNA稳定性，一般细胞都应该呈现阳性。阴性对照polyA25 RNA和哺乳动物细胞裂解液mRNA不结合，也不包含HuR或poly（C）BP结合位点。
简略步骤
本试剂盒的蛋白的富集程序已经过优化，步骤原理下图。首先将生物素标记的RNA结合到磁珠上，以使生物素的RNA定向结合特异性蛋白质。亲和素的磁珠与生物素的RNA结合。将结合RNA的磁珠在蛋白质-RNA结合缓冲液中平衡。通过添加适当的缓冲液，涡旋并在磁力架上分离，洗涤磁珠。接着使用SDS-PAGE上样缓冲液洗脱样品，然后进行后续检测。
注意事项-1：准备工作
（1）制备目的RNA、纯化，然后自行标记生物素或直接联系我们，外显子生物提供RNA探针的制备和标记，价格2800元40-50次；
（2）金属浴或水浴锅；
（3）氯仿：异戊醇（24：1）、无水乙醇；
（4）细胞裂解液，外显子实验室可提供；
（5）洗脱缓冲液：SDS PAGE上样缓冲液；
（6）含0.05％Tween-20洗涤剂的TBS-T溶液；
（7）1.5ml磁珠分离架，外显子生物实验室有售，250元/个；
（8）蛋白质印迹用的PVDF膜、HRP山羊抗小鼠IgG（H+L）、WB化学发光底物。
注意事项-2：实验过程
（1）生物素RNA作为探针是本实验的关键。
（2）操作使用标记的RNA时，请保持无核酸酶的环境。戴上手套，口罩防止RNA酶。
（3）不要冷冻或干燥链霉亲和素磁珠，冷冻或干燥会导致珠粒聚集，失去活性。
（4）为了减少蛋白质降解，在细胞裂解液制备中加入蛋白酶抑制剂。
（5）将SDS-PAGE还原样品缓冲液中的磁珠煮沸时，沸腾使磁珠失去结合活性不能重复使用。
详细步骤
第一步 亲和素磁珠的准备
（1）保持无核酸酶的条件，用0.1% DEPC溶液喷洒或擦拭清洁工作区域，戴手套，口罩；
（2）取出磁珠，旋转10秒，将磁珠重悬，吸取100μl，然后转移至无核酸酶的离心管内。
（3）将试管放在磁力架上，磁珠自动保留到试管侧面。用200ul的0.1M NaOH，50mM
NaCl（无核酸酶）洗涤磁珠两次。在100mM NaCl中洗涤一次，溶解平衡磁珠备用。
第二步 裂解细胞（同WB，注意裂解蛋白浓度）
（1）将细胞加入裂解液，确保细胞裂解物蛋白，浓度务必大于2.0mg / mL，方便在使用结合反应缓冲液时，保证其影响不大。如果裂解物中盐多，可以透析或者用盐离子洗脱柱。
第三步.标记的RNA与链霉亲和素磁珠结合
（1）每50μL磁珠结合100pmol RNA左右，以下说明使用50pmol RNA到50μL磁珠。
（2）试剂盒包括阳性和阴性RNA对照。为确定用户RNA蛋白结合的特异性，第一次请使用
阳性，阴性对照。
（3）在1.5mL微量离心管中加入50μL的链霉亲和素磁珠。放入磁力架中，磁珠靠在试管
的侧面，丢弃上清液。
（4）用等体积的20mM Tris（pH 7.5）洗涤，涡旋重悬珠。重复步骤洗涤一次。
（5）于磁力架上，磁珠收集在试管侧面，丢弃上清。加入50uL 1X RNA Capture Buffer。
（6）将50pmol的标记RNA添加到珠子中，轻轻混合。室温下搅拌孵育15-30分钟。
第四步.RNA结合蛋白与RNA结合
（1）将试管放入磁力架中，使磁珠靠在试管的侧面，丢弃上清液。用等体积的20mM Tris（pH 7.5）洗涤，涡旋重悬珠。
（2）重复步骤（1）。
（3）将试管放入磁力架中，磁珠靠在试管的侧面，弃上清液。将10XRNA-蛋白质结合缓冲液稀释至1X（即1：9超纯水稀释）。将100μL 1X蛋白质-RNA结合缓冲液添加到磁珠混合。
（4）准备RNA-蛋白质结合反应的预混液：
10X蛋白质-RNA结合缓冲液 10 5-20微升
50％甘油 30 0-50微升
其他盐等（可变） X 体积
裂解液（蛋白质浓度2mg / mL 1-30 20-200微克
无核酸酶的水 至100 至100μL
（5）将试管放入磁力架中，以将磁珠收集在侧面，丢弃上清液。
（6）将100μL的预混液添加到结合RNA的磁珠中，通过移液器或轻轻涡旋混合。
（7）在4°C下搅拌或旋转孵育60分钟。
第五步. RNA结合蛋白复合物的洗涤和洗脱
（1）将试管放入磁力架中，使磁珠靠在试管的侧面。将上清液转移到试管中以备后用。
（2）用等体积的1X洗涤缓冲液（100μL）洗涤。
（3）再重复两次步骤1和2。如果需要，请保存洗涤上清液以进行分析。
（4）将试管放入磁力架中，使珠子靠在试管的侧面。将上清液转移到试管中以备后用。
（5）向珠中加入50μL洗脱缓冲液，并涡旋混合均匀。于37°C搅拌孵育15-30分钟。
（6）将试管放入磁力架中，以将磁珠收集在试管侧面。除去上清液用于下游分析。
（7）如果下游应用是蛋白质印迹，将原样品缓冲液添加至样品至1X。
（9）在95-100°C下加热洗脱的样品5-10分钟。电泳凝胶上或在-20°C储存直至使用。
（10）对于对照反应，每泳道加30μL。
第六步.蛋白质印迹分析
注意：细胞裂解物泳道作为对照，以验证蛋白质印迹是否正常运行。
1.通过SDS-PAGE分离蛋白质，并转移到硝酸纤维素膜上。
2.在室温下，将膜在含有5％牛血清白蛋白（BSA）的TBS-T中封闭1小时。
3.准备在10mL含5％BSA的TBS-T中包含10μL抗HuR抗体（〜36kDa）的溶液。
4.在室温下将膜在抗HuR抗体中孵育4小时，或在4°C过夜。
5.用TBS-T清洗膜5次，每次5分钟。
6.将山羊抗小鼠IgG（H + L）（HRP共轭，1：20,000）稀释到含有5％BSA的TBS-T中。
7.将膜在稀释的山羊抗小鼠IgG中于室温孵育1小时。
8.用TBS-T清洗膜5次，每次5分钟。
9.将膜与化学发光底物在室温下孵育（例如，SuperSignal West Pico化学发光底物）。
10.立即将胶片暴露在X射线胶片或CCD相机上进行适当的曝光。
