(1)收集:染色体以 50g离心力 离心 3 分钟,将含有染色体的上清液转移到干净离心管中。再次将染色体悬浮液以 50g离心力 再离心 3 分钟,上清液移入新的离心管中,主要除去染色体提取物中存在的大部分细胞核和细胞碎片。
(2)纯化染色体:将悬浮液利用针头吸入 3或5ml注射器。然后穿过无菌尼龙网,分离和提取的染色体(外显子生物,货号:001.503),用 DNA 结合染料(如 DAPI)来确定,荧光下观察以确定该等分试样中的染色体数量。
(3)将上述尼龙网用0.9%氯化钠溶解,制成106 条染色体/ml 样品的染色体悬浮液,在1 ml 的缓冲液中稀释,并通过加入 20 滴 3:1 甲醇:乙酸固定液,轻轻旋转悬浮液进行固定。然后将染色体以 350g 离心 10 分钟,去除上清液。将 1 ml 体积的相同固定剂添加到轻弹的沉淀中,在室温下孵育 30 分钟。在相同条件下离心后,除去上清液,加入1ml新鲜固定液。
(4)离心去除上清液后,将染色体沉淀重悬于 160 μl 预热的杂交缓冲液(40% 去离子甲酰胺、4×SSC、2×Denhardt 溶液,外显子生物,001.504)中。将体积为 2.5 μl 的用所需要的生物素染色体探针78℃预热5分钟, 添加到染色体悬浮液中,将整个混合物在 73°C 下变性 3.5 分钟。然后将其在冰上保持 5 分钟,在 37°C 振荡中孵育 2 0 小时左右。
(5)离心和重悬,在 500 μl 预热的 0.1×SSC 中获得标记的染色体。将染色体离心并将沉淀物重新悬浮在 2×SSC 中。将 15 μl 的等分试样用 DAPI 染色以确保染色体存在。
(6)将亲和素磁珠与 1×106 探针结合的染色体悬浮在 100 μl 缓冲液中,该缓冲液含有 0.05% (v/v) 吐温 20 和 5% (v/v) 脱脂干牛奶。悬浮液在 37°C 振荡水浴中孵育 2 小时。然后将悬浮液转移到方形比色皿中,通过将比色皿的一侧暴露于条形磁铁来收集珠结合部分。通过将等体积的样品和预热的 2.0 M 羟胺·HCl 溶液(pH 8.5)在 37°C 下搅拌 4 小时来切割珠子。
(7)裂解的磁珠可以通过暴露在磁场中来收集。也可以通过以 350g 离心样品并吸出上清液收集含有染色体的离心沉淀来去除过量的成份。
(8)将分离的染色展在显微载玻片上,进行后续实验。