【产品名称】
多色免疫荧光显色试剂盒
【产品货号】
CB0023
【产品规格】
100人份
【储存条件】
2-8℃储存，密封避光
【生产日期】
见外包装
【有效期】
有效期12个月
【用途】
用于石蜡组织切片、冰冻组织切片、培养细胞的多靶点免疫荧光染色
【染色原理】
E-TSA多靶点免疫组化染色试剂盒采用酪胺信号放大技术（TSA,Tyramide Signal Amplification），利用辣根过氧化物酶（HRP）介导的酶促反应对靶蛋白进行多位点原位标记，大幅提高检测的灵敏度和信噪比。TSA标记是共价键结合，非常稳定，在抗体洗脱时抗体复合物被去除而TSA染料的结合不受影响，从而解除了抗体种属对染色的限制。因此可以使用同一种属来源的一抗进行多靶点标记。通过采用不同荧光标记的TSA染料实现对组织样本的多靶点染色。
【检测样本】
1. 不同物种的活检或手术切除样本；石蜡组织切片，冰冻组织切片，混合培养细胞。
2. 组织离体后使用10%中性福尔马林固定，固定时间8-48 h最佳；
3. 建议组织切片厚度3-6μm，使用防脱载玻片。
【所需实验设备及耗材】
实验设备：
离心机,漩涡混匀器,恒温孵育杂交仪
实验耗材：
晾片板、防脱载玻片、盖玻片、量筒、移液器、EP管、移液器吸头
【其它实验试剂】
灭菌去离子水,PBS,
【荧光染料光谱及包装信息】
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货号 |
荧光染料 |
激发波长（nm） |
发射波长（nm） |
储存状态 |
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CB0023-DAPI |
DAPI-Antifade Solution |
353 |
442 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-01 |
TSA-DEAC |
426 |
450 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-02 |
TSA-A488 |
493 |
517 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-03 |
TSA-Cy3 |
550 |
570 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-04 |
TSA-Cy3.5 |
581 |
596 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-05 |
TSA-Cy5 |
649 |
670 |
-20℃，溶液 |
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CB0023-06 |
TSA-Cy5.5 |
675 |
694 |
-20℃，溶液 |
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【其它试剂包装信息】
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货号 |
试剂名称 |
储存状态 |
试剂颜色 |
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CB0023-B1 |
Hybridization Buffer |
4℃，溶液 |
无色透明 |
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CB0063-B2 |
TSA稀释液 |
4℃，溶液 |
无色透明 |
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CB0023-B3 |
抗体稀释液/封闭液 |
4℃，溶液 |
淡黄色透明 |
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CB0023-B4 |
Anti-Dig-HRP或avidin-HRP |
4℃，溶液 |
无色透明 |
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CB0023-B5 |
Washing BufferⅠ（10X） |
4℃，溶液 |
无色透明 |
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CB0023-B6 |
SolutionA |
4℃，溶液 |
无色透明 |
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CB0023-B7 |
SolutionB |
4℃，溶液 |
无色透明 |
【工作液配制】
用抗体稀释液/封闭液将酶标Anti-Dig-HRP或avidin-HRP浓缩液按照1：100稀释配置为二抗工作液（使用前半小时内配置，请勿提前配置）
DAPI工作液
即用
*建议每张切片单次加液为工作液50-100 μl
【实验操作】
注意：开始实验前请确认实验所需设备、耗材、其它试剂等均已准备完毕，仔细阅读【工作液配制】部分并按照要求配制工作液。不同组织切片可能有所差别,具体实验条件根据实际情况进行调整。
1. 玻片预处理
烤片和脱蜡水化流程抗原修复
1.1 取玻片放在原位杂交仪的烤片台上90℃烤片 30分钟
1.2 取出玻片，放于二甲苯中室温侵泡两次每次10分钟
1.3 取出玻片，于梯度乙醇(无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇)中室温侵泡各5分钟
1.4 取出玻片，于PBS中3分钟
1.5 取出玻片，3%H2O2侵泡10分钟，于PBS中2分钟
1.6 EDTA(pH9.0)20分钟，100℃煮片（如果组织切片比较容易掉片可以用98℃水浴），于PBS中2分钟
（如果是冰冻组织切片1.1取切片，室温放置20分钟，PBS泡5分钟，1%多聚甲醛侵泡10分钟1.2 PBS洗2次每次5分钟 1.3滴加SolutionB室温处理10分钟，PBS洗2次每次5分钟）
1.7 胃蛋白酶处理液37℃孵育15分钟，于PBS中侵泡2次每次5分钟
1.8 95%乙醇侵泡2次每次2分钟，晾干
2. 封闭
2.1 Hybridization Buffer 100 μl，15分钟，室温封闭
3. 原位杂交探针（可以1-5种）同时孵育
3.1 特异性探针（Dig或生物素标记探针）：Hybridization Buffer =1：50配成工作液（可多个不同标记的探针同时孵育），每张片子滴加50-100μl封闭2小时，40℃
3.2 Washing BufferⅠ（1X）洗 3次每次5分钟
4. 抗体稀释液/封闭液室温下封闭30分钟
5. HRP二抗孵育
5.1 滴加HRP二抗（地高辛或生物素）工作液50-100μl，1小时，37℃
5.2 Washing BufferⅠ（1X）洗 3次每次5分钟
6. TSA显色
6.1 TSA染料工作液50-100μl，8-15分钟，室温避光
6.2 Washing BufferⅠ（1X）洗 3次每次5分钟
7. 滴加SolutionA室温处理10分钟，PBS洗2次每次3分钟
*重复步骤3-7，直至完成最后一轮染色;若只有一次TSA显色，直接进行步骤8，无需步骤7
8. 滴加DAPI染液盖玻片封片，室温避光20分钟
*实验步骤中所有条件均为建议条件，具体实验条件根据实际情况进行调整。
【产品性能描述】
染色完成后使用全景荧光扫描仪进行图像采集和分析，图像采集参数为曝光强度100%；曝光时间5ms；信号表达在细胞膜上，且信号背景干净。
【注意事项】
1. pH值对染色有影响，载玻片应清洁、无酸碱污染，否则影响染色效果；
组织染色后及时成像，如需储存请-20℃避光。
以下是代表性结果，双色原位杂交,2个mRNA共定位。
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