流式细胞术检测真菌的方法学实践

流式细胞术应用广泛，外显子生物利用流式细胞术与FISH技术结合，对培养的细菌、血液微生物，血液培养、痰液、肺泡灌洗液、污染的食品痰进行核酸探针液体杂交，然后行流式分析，发现探针杂交后细菌能很好地应用于流式分析和分选出目的细菌，可以在感染血液、痰液等上述样品中快速检测和识别感染的种水平的微生物。

与常规实验室方法PCR、测序、培养等技术。流式-FISH结合的方法，快速检测特定的细菌，初步试验还表明不仅可以检测细菌，还可以检测真菌属种，柯检测常见感染10多种微生物，如肺炎克雷伯氏菌属肺炎克雷伯菌，链球菌、金黄色葡萄球菌，致病大肠杆菌等等，本文我们针对开发一些真菌，如白色念珠、平滑、近平滑等等真菌进行简述，此外，寄生虫原位杂交将在后续实验中继续开发。

流式细胞术的标本如何处理呢？流式细胞技术应用于原位杂交，对标本处理要求不同，不需要用福尔马林固定，标本经过酒精等有机溶剂适当处理，适合用于快速鉴别在各种肺部感染、败血症患者、肠道感染微生物检测，能达到属或种的水平检测。

真菌在临床上比较常见，其检测面临一定难度，有些培养困难，时间久，培养难等问题，PCR和测序技术鉴别时间长、扩增特异性也存在一定难度。我们实验室应用特异性荧光原位杂交探针，与经过处理的真菌进行杂交。能够快速检测真菌的存在，我们利用常见的四种真菌为研究对象阳性对照，同时利用临床样本为未知检测额对象。其结果显示，真菌可以被液体原位杂交所检测。

本实验所开发的流式检测念珠球菌常见类型，念珠球菌已发现有270余种，其中引起人类致病的念珠菌主要有白色念珠菌(C.albicans)、热带念珠菌(C.tropical)、假热带念珠菌(C.pseudotropicalis)、近平滑念珠菌(C.parapsilosis)、克柔念珠菌(C.kruseii)、星形念珠菌(C.stellatoidea)、光滑念珠菌(C.glabrata)、高里念珠菌(C.guilliermondii)，均为条件致病菌，其中以白色念珠菌毒力最强，最常见。念珠菌在普通培养基上生长较快，为椭圆形芽生细胞，在特殊培养基上形成菌丝。菌种的鉴别需依靠生化试验。

（一）  材料和方法

本实验流式细胞仪采用的孚流赛斯生物公司，检测标本为：血液、痰液、分泌物、棉拭子等液体体液标本。来源于临床样本，进行了灭活处理。采用的原位杂交探针、设计、标记、标本处理试剂盒、优化实验步骤均来源于外显子实验室。

（二）流式细胞检测细菌实验步骤

（1）  血清、污水、呕吐物、牛奶，腹腔积液等，适当的处理，8000rpm，离心1分钟；

本研究用的是真菌四种培养液，里面独立包含四种真菌，我们仅仅需要用溶菌酶处理30分钟；然后吸取20μl，开展后续实验。

（2）  混合培养液，吸取真菌培养液或其他含有真菌或细菌的上清20μL，加入细菌酶或真菌酶，0.5-1小时后，将配置好的核酸探针，85℃加热样品5分钟，60℃孵育0.5-2小时；

（3）  不必洗涤，吸取一定量杂交溶液，进行等5倍比例稀释，进行流式细胞仪上机检测，流式务必做好对照。包括只含空白探针对照、单纯待检测样品对照、待检测样品对照。

（4）  结果分析，设门的时候需要考虑颗粒大小，细胞一般20-50μM，细菌要小一些，真菌要大一些来参考，参考阴性对照，阳性荧光变化参考对照。

（三）流式细胞检测真菌的结果分析

1.热带白色念珠球菌的检出率约28%，描述（略）。

 

2.光滑白色念珠球菌的检出率约36%，描述（略）。

 

3.白色念珠球菌的检出率约64%，描述（略）。

(四)讨论

略

外显子生物专业提供各种荧光原位杂交探针试剂盒多年，核酸探针涵盖DNA、mRNA、miRNA、cicrRNA、LncRNA、nascent RNA、piRNA、细菌、真菌、寄生虫等原位杂交探针以及配套试剂盒和配套原位杂交检测设备，优化实验条件。熟练、快速、精准的应用各种核酸探针标记方法，并开发一些新的标记方法。

如果遇到更多问题，请联系我们。我们提供探针、试剂盒、耗材、设备等等。

联系电话：020-89895006  180 1199 7127  E mail：focobio@126.com

 

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