1.实验试剂、材料与仪器

试剂：1mol/L NaOH溶液、2×SSC/0.1%NP-40（洗液）、75%、85%、100%乙醇、变性液、DAPI、

材料：盖玻片、0.2ml PCR管、湿盒、

仪器：水浴锅、PCR仪、染缸、玻片盒、恒温培养箱、冰箱

2.实验步骤

（1）精子涂片

（2）精子核去凝集

划定杂交区域（约20×20 mm），滴加1mol/L NaOH覆盖杂交区，在显微镜下观察，直到精子头部是原来的2倍，且精子头部呈圆形，边缘清晰，约1.5-2min。2×SSC浸泡2min，洗去NaOH（后续实验须在pH7.0-8.0条件下进行，必须除去残留的NaOH）；

（3）老化

2×SSC浸泡10min。

（4）脱水

依次在75%、85%、100%乙醇中浸泡2min，晾干。

将75%、85%、100%乙醇放入冰箱-20℃预冷，待变性后脱水用。

（5）变性

加入约20mlDNA变性液到玻片盒，水浴加热至77±2℃，轻轻将玻片放入玻片盒中，77±2℃变性5min，取出后马上依次放入预冷的75%、85%、100%乙醇各2min，晾干。

注意：必须等玻片的杂交区域完全干燥，再滴加探针。

以下步骤，注意避光

（6）探针准备

按每张片子6μl探针计，根据片子数量n，微量移液器取6×n μl探针至0.2ml PCR管，探针94℃变性4min，37℃平衡2min。

（7）杂交

平衡后的探针滴加在标本上，盖盖玻片，放入湿盒中，37℃-42℃杂交过夜。

（8）洗涤

将玻片移至已经预热至42℃的洗液中，浸泡5min，再移至常温的洗液，浸泡5min.

（9）复染

滴加20μl DAPI，盖盖玻片，暗处静置15min，荧光显微镜观察（先用低倍镜找到视野，再用100倍油镜观察）。

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