动物胚-胎原位杂交实验步骤

一、本原位杂交实验步骤适合：

(1)非洲爪蟾，线虫，小鼠胚胎，小昆虫、果蝇等

(2)应用范围：

整体原位杂交，胚胎原位杂交，RNA探针，DNA探针，NBT/BCIP，二抗显色；

(3)需要的耗材：透明可立玻璃瓶2.5mL或24孔板（外显子生物科供），1.5ml离心管，10ml离心管，15ml离心管，枪头，封口膜，FISH封片胶、FISH钻石笔（外显子生物可供）。

（4）需要的设备：烤箱，原位杂交仪（外显子生物，型号：E308（3200元）或型号：EB405，3200元、2.5万）；双孔水浴锅；

二、胚胎固定

1.取材： 按照正常胚胎取材，如冰箱冷冻的标本，则需要固定前使用2.5％半胱氨酸（pH 8.0）（具体货号请见参考目录）对胚胎进行去冻。使用细镊子在固定之前移除胚胎包膜。具体方法：用玻璃巴斯德管或剪去一部分的枪头转移胚胎，用酒精灯的火焰熔化锋利的边缘，以减轻伤害胚胎，以便拾取胚胎。

注意：（1）使玻璃移液管注意温度，避免灼伤胚胎；（2）标本过老或放置过久，会出现背景；（3）标本过大，可以用针穿刺，使得探针或染料充分进入；（4） 可以将标本放入无水乙醇，标本变硬，切成两部分。

2. 标本固定：

（1）准备上述杂交瓶或24孔板，用于胚胎固定。 这些样品瓶可用最终标本的储存。透明小瓶最好，可观察胚胎。 使用钻石笔或油性Maker标记笔标记小瓶，用透明胶带覆盖标签，接触的醇和其他溶剂会导致标记物笔迹的消失。

（2） 配制或购买：用Mempfa修复固定胚胎（具体货号和配方见后面参考目录）；4％多聚甲醛配制（具体货号请见参考目录）。

（3）配置Mempfa固定溶液， 确保多聚甲醛的最终工作浓度为4％。 将其他溶液的所有组分储存在2-8℃。用移液管或枪头将胚胎添加到已填充有约3-4mL Mempfa溶液的璃瓶中来固定胚胎。 每个小瓶固放置胚胎数量根据大小调整。 Mempfa溶液中的胚胎在室温下固定2小时或在4℃下固定过夜。

注意事项：1）对于晚期内胚层结构，在分离的肠和内胚层衍生物上进行固定，便于探针的穿透且避免腔染色。2） 在-20℃下储存100％甲醇溶液。多聚甲醛固定后, 用约4毫升-20℃,100％甲醇替换Mempfa溶液，用于储存胚胎。3） 加入甲醇后旋转小瓶以防止胚胎粘在玻璃或其他胚胎上。 另外，确保小瓶密封，甲醇会随着时间的推移在冷冻室中蒸发。4）胚胎可以在染色前在甲醇中储存至少一年，不会影响原位杂交质量。

（4）具体步骤：

1. 水化胚胎：75%, 50%, 25% 甲醇/PBS-T，可以在合适的离心管。洗涤一次PBS-T。以上每步均是5分钟。

2. 蛋白消化： 10 μg/mL 蛋白酶K/ PBS-T （目录中的蛋白酶K是20mg/ml）

1）胚龄胎龄 6.5-7.5 d的消化5分钟； 8.5天的消化 10 min；9.5天的消化15 min. 10.5天的消化 20 min. 2）其他组织：可以用0.5 μg/mL的蛋白酶K处理 5 min。3）组织的厚度和硬度适当调整消化程度。4）薄的组织和疏松组织，可以不用蛋白酶K消化。

3．停止消化：

在 4% paraformaldehyde/0.1% glutaraldehyde 溶液浸泡20分钟。

4.失活蛋白酶K：加入适量的2 mg/mL glycine/PBS-T（参见目录）。

5．洗涤洗涤胚胎：

在PBS-T中一次，5分钟。 再用1:1 的PBST/杂交液（货号参见目录）洗涤一次。

6. 彻底洗涤： 利用胚胎杂交液再次洗涤一次。

7. 放入新的 杂交液, 孵育1-24 h，温度 65°C-70°C。如果停止实验，此步骤可以放置-20°C存放。

8. 探针杂交：探针浓度0.1-1 μg/mL的DIG-labeled RNA probe或其他探针（外显子生物提供制备服务），杂交 65-70℃. 12-48，摇动孵育。

二、探针的制备

1.使用1-2μg模板RNA制备地高辛（Dig）标记的探针或其他探针。 制备：用含有目的基因的载体，限制酶切割，含T3或 T7或U6启动子酶反转录产生反义探针和正义探针。也可以从外显子生物购买探针直接解决问题。

2.探针合成制备的反应，探针标记温度37℃条件下时间不超过2小时。反应具体内容请参考相关资料或咨询我们。 最后在高盐和冷冻条件下沉淀RNA探针。

3. 孵育2小时后，在转录反应中加入1μL DNAseI（RNAse free grade），并在37℃下再孵育10分钟以消除模板DNA。

4.制作琼脂糖凝胶，测试探针的浓度和纯度。

（1） 取出1μL反应混合物，检查1％琼脂糖-TAE凝胶，剩下的（19μl）加入80μl含1％ SDS的TE缓冲液（10mM Tris pH8.0,1mM EDTA）， 10μl 5M 醋酸和220μl冷乙醇。 剧烈涡旋混合物并置于冰上，待RNA质量检查结果出来，决定下一步。

（2）在1％琼脂糖-TAE凝胶上沉淀之前，吸取1μlRNA。向RNA中加入4-5μl水和1μl标准上样染料。 使用UV光透射仪在凝胶上观察RNA，检查探针质量。

（3） 如果质量可以，微量离心机中高速离心探针，15分钟，沉淀留在冰上的剩余RNA，吸出上清液，让其短暂干燥。

（4）1mL RNA杂交缓冲液，重悬探针。 涡旋并将管短暂加热至37℃，离心， 将探针转移到15ml螺旋盖管中，用RNA杂交缓冲液填充至7-10ml。

注意：探针可以进一步稀释（稀释10倍仍然可以）通常导致背景低，但染色反应也需要更长时间。

三、原位杂交

1. 取出储存在-20℃甲醇中的胚胎，至室温。

（1）水化胚胎： 将胚胎再水化，准备添加探针。 每次更换液体，旋转胚胎以确保它们不会粘附， 转移液体时，检查盖子内部以确保胚胎没有被粘附。

（2） 将杂交液体加入瓶内含探针），65℃预热RNA杂交缓冲液和探针，胚胎杂交过夜。

2. 倒出探针溶液，将使用过的探针，放在15毫升试管中，标记日期和探针使用次数，温度为-20℃，可以反复利用。

 3.洗涤：探针倒出后，进行一系列洗涤，将准备对胚胎上的探针进行抗体染色。（第二天 杂交后洗涤，用预热的杂交液洗涤两次，温度：65-70℃，更换液体即可。 更换新的离心管，将封闭液体导入其中，放入胚胎。5min后，再更换一次。用1:1 hybridization mix/MABT孵育5min。用MABT孵育15 min。室温MABT/2% blocking 孵育1-2小时。在4℃，孵育二抗过夜，或室温至少4小时，抗体1：2000稀释。）

4.胚胎在MAB + HTSS + BR（参见目录货号）阻断溶液中孵育后，加入适当体积的MAB + HTSS + BR +抗Dig抗体。

5. 二抗体孵育过夜：去抗体洗涤，将胚胎转移到MABT溶液，1.5小时更换溶液，3-5次。MABT溶液浸泡胚胎过夜，低温最好。进行至少12次30分钟的洗涤 ，减少背景。使用TBT溶液进行洗涤步骤。

6. 用碱性磷酸酶底物溶液替换洗涤溶液（一定用碱性溶液，参见目录）。AP显色，37℃条件下进行。也可4-8℃条件下，显色 1-4 天。直到背景出现。当颜色合适的时候，利用PBS-T洗涤至少两次，5分钟每次，然后 4% PFA/0.1% glutaraldehyde/PBS-T 固定2小时室温。标本可以放置： 4°C，PBS-T 包含 0.1% 叠氮钠的溶液中（参见目录货号）。

注意：在37℃下染色更快，如果放置过夜，会导致不可接受的背景染色。染色反应通常需要过夜染色，室温对此最安全。

显色注意事项：1）BM紫色溶液呈蓝色，则用新鲜的BM Purple替换染色溶液并将管放37℃。如果靶mRNA非常丰富，将胚胎置于4℃的染色溶液中过夜，然后将胚胎移至室温或37℃，以更好地检测染色反应。2）不同靶RNA之间的最终结果时间差异很大。为保持一致性，当孵育时间较长时没有新的变化时，停止染色反应。重要的是，对照胚胎之间用相同的时间进行颜色反应。3） 通过FISH显色终止液停止染色，准备胚胎储存和拍照，不要在此阶段摇动胚胎。注意：胚胎通常是淡蓝色阳性信号，冷甲醇可以少部分地除去染色溶液，不能去除重的背景或腔染色。冷甲醇是指保存在-20℃冰箱中的甲醇。4）将胚胎再水化并用Mempfa固定。固定后，取出Mempfa并用25％甲醇洗涤胚胎。5）去除内源性色素，则除去25％甲醇并加入内源性酶AP去除溶液（参见目录）。仔细观察漂白可以根据不同的效果而变化。6）将胚胎通过甲醇系列脱水至100％甲醇，转移至PBS进行短期和拍照。

四、胚胎成像

（1）胚胎染色后，对胚胎进行成像处理，获得目的基因的表达，可以使用1％琼脂糖作为背景来观察。注意：琼脂糖呈现灰色背景，与胚胎和染色反应的蓝色形成鲜明对比。

（2）将琼脂糖加入水中，然后煮沸直至琼脂糖溶解，然后冷却至50℃，然后倒入培养皿中。与TAE凝胶溶液一样，将琼脂糖溶液储存在55℃的培养箱中可多次使用。

（3）将甲醇储存标本再水化成水溶液（PBS），将胚胎放入培养皿中加入琼脂糖。保持溶液清洁，如果需要，简单的滤网过滤消除小颗粒，解决图像清晰背景的问题。

（4）为了从其他的角度（如腹侧）对胚胎进行拍照，在琼脂糖中切出薄的通道，使用细镊子将胚胎放入胚胎中并将胚胎置于这些通道中进行定向。 小心操纵胚胎，它们容易受损。

注意：每个阶段有独特的位置，放入溶液时会有特征位置。例如，囊胚期胚胎倾向于把动物放在一边。一旦胚胎开始伸长，它们就会侧卧（外显子生物提供提示体式显微镜拍照服务）。

2. 使用体式显微镜角度照射胚胎，胚胎上形成阴影，为图像提供深度并帮助识别表面结构。

3. 将胚胎背景清除，以便对胚胎深处进行染色成像。例如脊索，肺或大脑区域。为此，将胚胎通过甲醇系列直至100％甲醇。（1）完全浸入甲醇后，将胚胎转移至一份苯甲醇和两份苯甲酸苄酯（BABB）的溶液中。胚胎最初漂浮在表面上，但当甲醇与BABB混合时，它们会沉入BABB。在玻璃瓶中处理BABB的每一步; BABB会熔化任何塑料或油漆。（2）清除后，用来自胚胎下方的透射光观察胚胎。调整光线强度以及从下方开始的角度，以提高对比度和最佳色彩。（3）当观察清除的胚胎时，将玻璃培养皿从基部上抬起。通过简单地使用另外两个培养皿盖来提升它，以便使具有胚胎的培养皿区域升高（外显子生物提供提示体式显微镜拍照服务）。注意：这样做的好处是消除显微镜底座上可能干扰图像的瑕疵或污渍的干扰。

胚胎常见溶液的配制：

（1）4%多聚甲醛；Paraformaldehyde（外显子生物有售）

水浴锅加热至50-60℃，溶解多聚甲醛。加入1-3滴10N NaOH或直至pH约为7.5（pH试纸即可）。 多聚甲醛毒性很大，因此在通风橱中产生原液。 一旦多聚甲醛处于溶液中，将溶液通过Whatman纸过滤到新鲜容器中，加H₂O补齐最终体积。一般多聚甲醛溶液在4℃下保存1-2周。

（2）PBS-T (PBS with 0.5% Tween 20) （外显子生物有售，粉末或溶液）；

（3）Methanol (25%, 50%, and 75%) in PBS-T（外显子生物有售）：

（4）10% 原位杂交胚胎专用封闭液（外显子生物有售，pH7.5）；

（3）固定液Glutaraldehyde (25%), 室温（外显子生物有售）；

 

 

 

 

表1 胚胎溶液目录配方

备注：外显子公司提供各种基因的原位杂交探针、原位杂交相关试剂和仪器耗材。

表2  相关溶液的使用说明

名称	大概剂量		持续时间	温度
100%甲醇	2ml		5min 摇匀	室温
75%	2ml		5min 摇匀
50%	2ml		5min 摇匀
25%	2ml		5min 摇匀
TTw	2ml		10min摇匀
TTw	2ml		10min摇匀
TTw	2ml		10min摇匀
TTw		4ml	5 min摇匀
TTw		4ml	5 min摇匀
RNA杂交缓冲液		2ml	10min摇匀
预RNA杂交缓冲液		2ml	1h摇匀	65℃
探针		1ml	过夜，摇匀	65℃

 

表3.AP Buffer（新鲜配制或从冰箱小包装解封 (NTMT)

Reagent	Amount to add	Final concentration
5 M NaCl	4 mL	100 mM
1 M Tris-Cl (pH 9.5)	20 mL	100 mM
1 M MgCl2	10 mL	50 mM
Tween 20	2 mL	1%
H2O	to 200 mL

备注：NTMT溶液  规格：100ml   价格:75.00元,无菌， 货号：PF0125

表4.胚胎杂交Hybridization Buffer

Reagents	Final concentration
SSC	1.3X
EDTA (pH 8.0)	5 mM
Formamide	50% (v/v)
CHAPS	0.5% (w/v)
Heparin	100 μg/mL
Tween 20	0.2%
Yeast RNA	50 μg/mL
The hybridization mix can be stored at −20°C

备注：胚胎FISH杂交液液  规格：100ml  货号：PF0130 价格:275.00元,无菌。

表4.MABT溶液

Reagent	Final concentration
Maleic acid (pH 7.5)	100 mM
NaCl	150 mM
Tween 20	0.1% (v/v)

备注：MABT溶液 货号：PF0040，规格： 100ml  价格75元。

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