原位杂交可以用于对培养细胞、水细菌、淤泥、粪便等，对细菌鉴定、细胞、计数，成为分子系统发育鉴别或基因表达分析的有力工具。然而，在液体中也可以对细胞、革兰氏阳、阴性细菌、某些环境细菌样品进行均匀核酸杂交，然后进行FISH、流式、显微镜观察分析面。开展溶液原位杂交的检测，在悬液中完成。在培养细胞、微生物中能区分多种细菌，包括芽孢杆菌，变形菌及分析细胞基因的表达。
试剂：抗荧光衰减试剂(含DAPI)、乙醇（50%，85%，95%、100%，冷存，固定）、FISH固定液、FISH杂交液、细菌培养基、标记的核苷酸探针、磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）、20XSSC（0.1X，pH 7.0）
设备：铝箔、盖玻片、离心机、移液器、吸头、显微镜、荧光显微镜（适当滤光片）、透明指甲油或抗荧光封片剂、分光光度计、培养管、微型离心管、水浴锅或杂交仪。
培养的细胞
1.将细胞接种到培养瓶，在指数最佳生长时候，进行细胞计数观察，将适当细胞密度用于比较杂交。
2.丢弃上清液，并将细胞用胰蛋白酶消化完全重新悬浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
3.以3,000 g离心5 min，丢弃上清液。
4.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新悬浮细胞。
5.加500 µl冷100%乙醇，将试管储存在−20°C。固定细胞可在−20°C下储存数月。
6.杂交之前，3000g，5 min使细胞颗粒化弃上清液，去除残留乙醇。
革兰氏阳性细菌固定
1. 细菌培养物，接种2 ml肉汤培养物并在最佳生长温度、培养基和培养条件下培养。培养后，进行细胞计数（或OD600分光光度计读数），以便将适当细胞密度用于比较杂交。
2. 在对数生长期（OD600 0.4-1.0），以13,000 g离心5 min获取细菌。在生长的对数期收集的细胞将提供较好的信号。如果需要，使用较大规模培养，但小规模的培养物也能为FISH提供足够的细胞数量。
3.丢弃上清液，并将细胞完全重新悬浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
4.以13,000 g离心5 min，丢弃上清液。
5.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新悬浮细胞。
6.加500 µl冷100%乙醇，将试管储存在−20°C。固定细胞可在−20°C下储存数月。
7.杂交之前，以13,000g，5 min使细胞颗粒化弃上清液。从细胞颗粒中去除残留乙醇。
革兰氏阴性细菌固定
1.对于每个细菌培养物，接种2 ml肉汤培养物，在培养基中以最佳生长温度培养过夜。培养完成后，进行细胞计数（或OD600分光光度计读数），以合适细胞密度用于比较杂交。
2.将每种培养物转移到2 ml微型离心管中，以13,000 g离心5 min。丢弃上清液。
3.在每管1 ml FISH用固定液中重新悬浮细胞颗粒，并在室温下培养3 h。
4.以13,000g离心细胞混合物5 min并丢弃上清液。
5.通过50%乙醇重新悬浮并在室温下孵育5 min，洗涤细菌。
6.以13,000 g离心试管2 min，丢弃上清液。
7.用80%和95%的乙醇重复步骤12-13。
8.通过吸引器或将试管置于快速真空干燥机中干燥细胞颗粒10 min。固定后可在4°C下储存1个月。
环境样品固定
对于环境样品，有必要包括未与标记探针孵育的样品，以评估样本的自发荧光。
1.尽可能使环境样品均匀化，减少聚集对获得探针可接近的单细胞悬浮液的不利影响。在杂交之前通过离心分离细胞或洗涤环境样品。
2.根据目标种群类别，对细菌固定方案。如果环境样品很可能含有革兰氏阴性和阳性细菌的混合物，并且有必要与针对革兰氏阴性和阳性细胞的探针杂交，那么在杂交之前，样品可用两次不同方法固定。
1.将固定细胞重新悬浮在500 µl FISH杂交溶液中，在37°C下培养30 min。完成后移除一份预杂交混合物的子样本（如50 µl）进行杂交。每个样品都能进行多次杂交，减少每个反应所需的探针。
2.混合物中加入荧光标记的寡核苷酸探针。
探针浓度应根据经验决定。几个因素可影响所需探针数量：探针灵敏度、样品密度和杂交时间。根据经验，将5 µl 100 ng/µl探针加到50 µl预杂交液,中可产生一致且均匀的荧光。
3.在37°C至65°C避光处杂交或用铝箔覆盖试管孵育2-3 h。如使用多个探针，建议65℃下进行杂交。根据所用探针和样品性质。根据经验42°C，改变甲酰胺浓度，可以达到所需的杂交效果。
4.以13,000 g离心混合物5 min并丢弃上清液。
5.通过在20 µl 0.1X SSC中重新悬浮细胞颗粒以清洗细胞，并在37°C的黑暗中培养15 min。
6.以13,000 g离心混合物5 min并丢弃上清液。
7.重复步骤22-23两次。
8.在20 µl 0.1X SSC中重新悬浮洗涤过的细胞颗粒。
9.在载玻片上制备样品：
i. 将10 µl样品转移到用乙醇清洗过的显微镜载玻片上。
iv. 储存载玻片于黑暗中。在观察前可在4°C的黑暗中保存至多1 周。
10.通过流式检测，选择正确的流式光源通道。
实验问题：
1. 杂交温度：更低的温度会导致探针杂交增加，但也会降低特异性。
2.去离子甲酰胺浓度：可能需要低浓度的甲酰胺。一般情况下，0%-40%的甲酰胺寻找合适的范围浓度。
3.探针浓度：根据给定探针对靶区的可达性，可能需要更多的探针进行充分杂交。
4.洗涤步骤中使用的SSC浓度：使用1X SSC代替0.1X SSC将降低洗涤步骤的严密性。
5.洗涤温度：37°C通常被认为是最佳洗涤温度，但以5°C为增量降低温度可以操纵洗涤条件的严密性。
6.洗涤步骤的次数：减少洗涤步骤的次数会降低杂交的严密性。但是，不建议进行少于两次的洗涤。
7.杂交混合物或制备的载玻片的储存条件：如果杂交混合物或制备的载玻片未在黑暗中储存或观察前的储存时间超过了建议的时长，则可能发生荧光降解。
8.探针没有与所需的细菌细胞特异性杂交。上述降低杂交严密性的因素也可以调整，以产生更严密的杂交反应。增加杂交和洗涤温度以及洗涤步骤的次数，将增加探针杂交的特异性和洗涤的严密性。杂交溶液中甲酰胺的含量也可以增加（不超过40%），分别修改上述变量，以确定理想的杂交条件。
9.荧光信号过大或有光漂白现象。如果观察到过量荧光或出现光漂白，应考虑以下因素：1） 细胞密度：在杂交反应中使用过多的细胞会使视场拥挤，难以观察到个体细胞。2）制备的载玻片的存放：制备好的载玻片应立即存放在黑暗中，直到观察开始，并且在观查过程中应尽快拍摄图像。
外显子生物是一家专注于核酸探针的公司，如需技术支持或核酸探针等原位杂交耗材设备请联系我们。我们竭诚为您服务。
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