Northern blotting 试剂盒（含地高辛探针）
一、试剂盒组成：
（1） 地高辛标记的目的探针 25T
（2） 样品预处理液
（3） 甲醛变性电泳上样缓冲液
（4） 10XMOPS溶液、洗涤胶溶液、RNA水解液
（5） 转膜液
（6） 杂交液
（7） 洗涤液I、洗涤液II
（8） NBT/BCIP显色底物
（9） NBT/BCIP显色缓冲液
试剂盒：25T
保存：2-8℃
货号：R2550
二、核酸样本准备与电泳：
Northern blotting是检测单一基因RNA表达变化首选方法，核酸电泳是变性条件下进行以除RNA二级结构。本试剂盒主要通过甲醛变性。然后将RNA转移到带正电荷的尼龙膜，再与地高辛探针杂交。
三、探针的获得：
Northern探针可以用PCR标记，随机引物标记，T7/SP6转录特异性RNA标记，末端转移酶法，DIG寡核苷酸末端标记，缺口翻译进行DIG标记，cDNA合成，外显子生物均可提供上述地高辛探针标记（约2000元，至少满足20次）。使用探针浓度约10-15ng/ml，探针长度变大，导致使用量变大。本试剂盒提供的探针是客户定制的地高辛标记RNA探针。
四、结果显色说明：
可以采用碱性磷酸酶底物NBT和BCIP，抗-地高辛过氧化物酶与NBT/BCIP反应。用于X底片显色。也可以选择其他显色方法。
五、实验操作步骤：
（1）RNA电泳样品准备：为防止RNA降解，请在冰上操作，10-20ug（2-4ul）的RNA与样品预处理液1:8体积混合，加热85℃10分钟，加入2ul甲醛变性电泳上样缓冲液混合，冰上待用。
（2）配胶：1.5%的琼脂糖可以分离0.5kb-1.5kb左右片段。称量1.5g琼脂糖加80ml纯水，煮沸，冷却到55℃左右（不烫手），加入10ml 10XMOPS和20ml去离子甲醛溶液，室温放置1小时。
（3）在5V/cm电压下，预电泳5分钟，加入样品和RNA Marker，电泳需要至少4小时，每隔1小时更换1X MOPS电泳缓冲液一次。
（4）将琼脂糖胶放在保鲜膜内，紫外灯下计算作图并标记，评估分子量的位置。
（5）在室温下将凝胶浸入洗涤胶溶液中20分钟，轻轻摇动。用RNA水解液浸泡凝胶20分钟，立即转膜。
（5）转模：按照下图制作转膜系统，利用试剂盒提供的转膜液通过毛细管转移到膜上，从凝胶吸取RNA到尼龙膜过夜，以确保RNA有效转移。
转模图（略）
（6）转模后，使用 UV交联湿膜，无需清洗。UV交联后，用H2O短暂冲洗膜，然后使其风干。或在120°C下烘烤，30分钟。可以用亚甲蓝溶液鉴定RNA的丰度。
（7）预杂交和杂交：将印迹膜放在包含20 ml预杂交溶液的杂交袋中，密封袋子，预杂交温度下预杂交2小时。探针浓度：10–20ng/ml，DIG标记探针，双链DNA探针，在沸水浴中加热10分钟使DNA变性，在冰上冷却。单链RNA探针和寡核苷酸探针在稀释前不需变性。准备至少3.5 ml杂交溶液，以满足10x10 cm的印迹。用杂交溶液稀释探针。丢弃袋子内预杂交溶液，添加包含DIG标记探针的杂交溶液。42℃条件下均匀摇动杂交15-18小时。
（8）洗涤：在室温下，将膜在洗涤液I中洗涤两次，每次5分钟，除去未结合的探针。在洗涤液II中清洗膜两次，每次清洗15分钟。
（9）杂交后洗涤，将膜在洗涤液I中平衡1分钟。在封闭溶液中轻轻搅动薄膜30-60分钟，封闭薄膜。
（10）地高辛二抗孵育：稀释抗高辛抗体，将3 µl Anti-Digoxigenin-AP添加到30 ml封闭液中并混合。在抗体溶液中将膜孵育30分钟。弃抗体溶液，在洗涤液I中轻轻洗膜两次，每次洗涤15分钟。
（10）曝光检测信号：弃洗涤液，在NBT/BCIP缓冲液中平衡膜2分钟。配置NBT/BCIP显色液，常规方法显色，NBT/BCIP一般2分钟-12小时内。
