二、核酸样本准备与转膜：

Sourthen blotting一般来检测基因组DNA中基因的变化，一般需要10ug基因组DNA，转模推荐尼龙膜或正电荷尼龙膜。转膜后探针将共价结合DNA。转膜时间 5-18小时，从5毫米厚的0.7％琼脂糖凝胶中获得15 kb分子的可接受转移; 如果片段是1kb大小，2小时即可。

三、探针的获得：

Sourthern探针可以用PCR标记，随机引物标记方法，T7/SP6转录的特异性RNA探针。末端转移酶在寡核苷酸的3'末端添加一个DIG-11-ddUTP.DIG寡核苷酸5'-末端标记：通过缺口翻译进行DIG标记，或cDNA合成，外显子生物均可提供上述探针标记。价格约2000元，至少满足20次。使用的探针浓度约10-15ng/ml，探针长度变化，导致使用质量很大，原因在于分子量不同。

四、结果显色说明：

可以采用碱性磷酸酶底物CSPD，底物NBT和BCIP，抗-地高辛过氧化物酶，抗地高辛FITC和抗地高辛-罗丹明。上述均可用于X底片显色。

五、实验操作步骤：

（1）凝胶电泳：使用合适的限制酶酶切DNA，保持获得15kb-0.5kb左右片段。准备适当百分比的琼脂糖凝胶。在凝胶上跑胶。如果需要，可用溴化乙锭对凝胶进行染色，以观察DNA片段是否转移到膜上。

（2）在室温下摇动将凝胶浸入脱嘌呤液体中8-10分钟，使得核酸容易杂交。

（3）进行变性之前，用H₂O冲洗凝胶2次。

（4）变性，中和和印迹

在室温下将凝胶浸入变性溶液中2 x 15分钟。轻轻摇动。用H2O冲洗凝胶。将凝胶浸入中和溶液中2 x 15分钟。用镊子在边缘检查它的pH值应低于9，否则膜将在杂交过程中变黄并破裂。

（5）转模：按照下图制作转膜系统，利用试剂盒提供的转膜液通过毛细管转移到膜上，从凝胶吸取DNA到尼龙膜过夜，以确保DNA有效转移。  

      转模图（略）

（6）转模后，固定膜上的核酸，使用 UV交联湿膜，无需清洗。UV交联后，用H₂O短暂冲洗膜，然后使其风干。或在120°C下烘烤，30分钟

（7）预杂交和杂交：推荐探针浓度：10–20ng/ml，DIG标记探针：20–50 ng / ml 将印迹膜放在包含20 ml预杂交溶液的杂交袋中，密封袋子，预杂交温度下预杂交2小时。双链DNA探针，在沸水浴中加热10分钟使DNA变性，在冰上冷却。单链RNA探针和寡核苷酸探针在稀释前不需变性。准备至少3.5 ml杂交溶液，以满足10x10 cm的印迹。在杂交溶液中稀释探针。丢弃袋子内预杂交溶液，添加包含DIG标记探针的杂交溶液。42℃条件下杂交15-18小时，最好摇动杂交。

（8）洗涤：在室温下，将膜在洗涤液I中洗涤两次，每次5分钟，除去未结合的探针。在洗涤液II中清洗膜两次，每次清洗15分钟。>100bp探针应在68°C下洗涤。对于较短的探针，降低清洗温度。注意：对于大多数应用在洗涤液II足够严格。凭经验确定是否有必要用洗涤溶液III，如果需要增加洗涤一次。

（9）杂交后洗涤，将膜在洗涤液I中平衡1分钟。在封闭溶液中轻轻搅动薄膜30-60分钟，封闭薄膜。

（10）二抗孵育：稀释抗高辛抗体，将3 µl Anti-Digoxigenin-AP添加到30 ml封闭液中并混合。与CDP-Star一起使用时，在封闭溶液中稀释Anti-Digoxigenin-AP 1：20,000。该工作抗体溶液在4°C下稳定约12小时。倒出封闭溶液，于制备的抗体溶液中将膜孵育30分钟。弃抗体溶液，在洗涤液I中轻轻洗膜两次，每次洗涤15分钟。

（10）曝光检测信号：弃洗涤液，在检测缓冲液中平衡膜2分钟。在化学发光前保持湿润。利用化学发光检测 可以将光信号记录在X胶片上。CDP-Star通常只需要15–60s的曝光时间，而CSPD的曝光时间通常是15–30分钟。NBT/BCIP一般120s内。

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