凝胶迁移试剂盒（EMSA Kit）
货号：R5130 规格：50T
本试剂盒室温运输，4℃储存。
试剂盒介绍：
电泳迁移率迁移分析，简称为“凝胶迁移”“EMSA”，生物素标记的DNA片段将含有特定DNA位点与DNA结合蛋白一起孵育。蛋白质DNA 通过非变性电泳将复合物与游离DNA分离，利用聚丙烯酰胺凝胶电泳。蛋白质阻碍了结合的DNA片段的迁移。从而导致游离的DNA比DNA-蛋白质复合物迁移更快。凝胶结果揭示游离和结合的生物素标记DNA的位置。
试剂盒成份：
1、Bovine serum albumin (BSA; 50μg/μL,5%)
2、Buffer A
3、DNA loading buffer（bromophenol blue）
5、DTT; 0.1 M
6、0.5× TBE and 1% glycerol
7、Glycerol (20% v/v)
8、MgCl2 (0.1 M)
9、Poly(dI-dC) (1 μg/μL)
10、TBE buffer (5×)
自行准备如下试剂：
1、 TEMED
2、 Gel-fixing solution (20% methanol and 10% acetic acid)
3、 Acrylamide mix (30%;acrylamide:bisacrylamide, 29:1)
4、 Ammonium persulfate (10%)
5、 Binding protein (0.5–100 ng/μL)
6、 亲和素-HRP
简略步骤
1. 准备40 mL的4.5％丙烯酰胺凝胶。
丙烯酰胺混合物6.0 ml；
TBE缓冲液（5×）4 mL；
甘油（20％）2ml；
H2O 28ml；
过硫酸铵（10％）300μL。
2. 在倒入之前，添加30μL TEMED，摇动均匀。
3. 倒入凝胶。
4. 在10 mA下将凝胶预电泳2小时。
5. 在0.5 mL微量离心管中加入：
*EMSA结合Buffer20μL；（可直接购EMSA 5X buffer）
1）重组蛋白（0.5–100 ng /μL）2.00μL；
2）生物素标记的DNA（1 fmol /μL）2.00μL；
3）聚dI-dC（1μg/μL）0.40μL；
4）牛血清白蛋白（50μg/μL）0.50μL；
5）DTT（0.1 M）0.20μL；
6）氯化镁（0.1 M）1.50μL
7）缓冲液D 13.40μL
备注：上述样品可以等体积扩大。
6. 将样品在30°C下孵育1小时或在室温2小时。
7. 非常小心地将样品直接加样（即不添加染料）到样品池孔的底部。10mA条件，启动电源4.5％天然聚丙烯酰胺凝胶。加入少量（例如5μL）的DNA上样缓冲液。
8. 溴酚蓝大约在凝胶的三分之二处迁移。通常运行4-6小时就足够了，取决于DNA片段的大小。
9. 凝胶电泳完成后，小心除去缓冲液。取出凝胶。拆下垫片并分离板，保持凝胶附着在一块板上。
10. 将凝胶浸泡在亲和素-HRP溶液（1:500稀释）中，可用塑料袋。在凝胶固定溶液中固定15分钟。
11. 将凝胶放在两张吸水纸上。用保鲜膜覆盖凝胶的顶部，在凝胶干燥器上于70°C放置1小时。
12. 将干燥的凝胶暴露在HRP显影液中，曝光显影。
原因排除
问题：没有绑定条带。
解决：通常表明该蛋白质未浓缩或未结合该位点，或缓冲液条件与电泳过程中的蛋白质结合不兼容。尝试更大蛋白质浓度，改变缓冲液pH和盐浓度，替代电泳运行缓冲液，或在较冷的房间中于4°C运行凝胶。
问题：条带过多。
解决：额外的条带通常是由非特异性结合引起的。尝试添加更少的蛋白质而更多DNA探针。
问题：凝胶不干净。
解决：表明电泳过程中蛋白质解离，而电泳中蛋白质过多。反应或在太高的温度下电泳凝胶。电泳更多的凝胶慢慢地，降低蛋白质浓度，尝试在冷室中运行凝胶，改变缓冲液条件，或添加更多竞争者DNA。
EMSA相关试剂：
EMSA/Gel-Shift 结合5XBuffer
货号：R5130-1
储存：-20℃
体积：300μl
EMSA/Gel-Shift 结合缓冲液(5X) buffer 成份
10×binding buffer
Poly(dI.dC)
鱼鲑精DNA
50% 甘油
100uM MgCl2
10% NP-40
使用步骤：
见本公司EMSA试剂盒说明书，同其他厂家试剂盒通用。
EMSA loading buffer (10X)
货号：R5130-2
储存：-20℃
体积：1 ml
EMSA Loading buffer 成份，
Ficol 400等
未添加苯青和溴酚蓝指示剂
使用步骤：
见本公司EMSA试剂盒说明书，同其他厂家试剂盒通用。
EMSA loading buffer (10X，含染料)
货号：R5130-3
储存：-20℃
体积：1 ml
EMSA Loading buffer 成份，
Ficol 400等
添加苯青和溴酚蓝指示剂
使用步骤：
见本公司EMSA试剂盒说明书，同其他厂家试剂盒通用。
Poly(dI-dC) (1 μg/μL)
货号：R5130-4
储存：-20℃
体积：100μl
EMSA 生物素结合探针（订制）
货号：R5130-X
储存：-20℃
体积：500μl
TBE buffer 5X
货号：R5130-5
储存：-24℃
体积：100ml
50% 甘油 灭菌
货号：R5130-6
储存：-24℃
体积：10ml
EMSA探针见本网站相关网页。
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