流式-原位核酸杂交（Flow-FISH）
流式技术被广泛应用，原位杂交也是70年代的技术。两者结合可用培养细胞、新鲜组织、污水细菌、淤泥、粪便，海水、植物等标本，可以对细胞、革兰氏阳、阴性细菌、环境细菌样品进行液体核酸杂交，接下来进行FISH检测或流式细胞术检测、甚至进行流式分选技术。
通过把FISH技术与流式联合应用，即Flow-FISH，可检测同时检测细胞微生物的核酸与抗体。Flow-FISH允许同时测量多个靶点。如亚菌株的分析或鉴定，用于哺乳动物细胞与不同的微生物作用机制。如研究细胞内病原体-病毒、细菌群、真菌群的发病机理，相互作用，如EB、HIV-1、新冠病毒如何在细胞内致病等规律。
（一）试剂：抗荧光衰减试剂(含DAPI)、乙醇（50%，85%，95%、100%，冷存，固定）、FISH固定液、FISH杂交液、细菌培养基、各种标记的核苷酸探针、磷酸盐缓冲盐水（PBS）（pH 7.4）、20XSSC（0.1X，pH 7.0）。
（二）设备：铝箔、盖玻片、离心机、移液器、吸头、显微镜、荧光显微镜（适当滤光片）、透明指甲油或抗荧光封片剂、分光光度计、培养管、微型离心管、水浴锅或杂交仪。
（三）培养的细胞
1.将细胞接种到培养瓶，在指数最佳生长时候，进行细胞计数观察，将适当细胞密度用于比较杂交。可以加入病毒、真菌、细菌进行相互作用的研究。
2.丢弃上清液，并将细胞用胰蛋白酶消化完全重新悬浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
3.以3,000 g离心5 min，丢弃上清液。
4.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新悬浮细胞。
5.加500 µl冷100%乙醇，将试管储存在−20°C。固定细胞可在−20°C下储存数月。
6.杂交之前，3000g，5 min使细胞颗粒化弃上清液，去除残留乙醇。
（四）革兰氏阳性细菌固定
1. 细菌培养物，接种2 ml肉汤培养物并在最佳生长温度、培养基和培养条件下培养。培养后，进行OD600分光光度计读数，将适当细胞密度用于比较杂交。
2. 在对数生长期（OD600=0.4-1.0），以13,000 g离心5 min获取细菌。在生长的对数期收集的细胞将提供较好的信号。如果需要，使用较大规模培养，但小规模的培养物也能为FISH提供足够的细胞数量。
3.丢弃上清液，并将细胞完全重新悬浮在1 ml的pH 7.4的1X PBS中。
4.以13,000 g离心5 min，丢弃上清液。
5.在500 µl 1X PBS（pH 7.4）中重新悬浮细胞。
6.加500 µl冷100%乙醇，将试管储存在−20°C。固定细胞可在−20°C下储存数月。
7.杂交之前，以13,000g，5 min使细胞颗粒化弃上清液。从细胞颗粒中去除残留乙醇。
（五）革兰氏阴性细菌固定
1.对于每个细菌培养物，接种2 ml肉汤培养物，在培养基中以最佳生长温度培养过夜。培养完成后，进行细胞计数（或OD600分光光度计读数），以合适细胞密度用于比较杂交。
2.将每种培养物转移到2 ml微型离心管中，以13,000 g离心5 min。丢弃上清液。
3.在每管1 ml FISH用固定液中重新悬浮细胞颗粒，并在室温下培养3 h。
4.以13,000g离心细胞混合物5 min并丢弃上清液。
5.通过50%乙醇重新悬浮并在室温下孵育5 min，洗涤细菌。
6.以13,000 g离心试管2 min，丢弃上清液。
7.用80%和95%的乙醇重复步骤12-13。
8.将试管置于真空干燥机中干燥细胞颗粒10 min。固定后可在4°C下储存1个月。
（六）环境水样、空气、污泥等固定
对于环境样品，有必要包括未与标记探针孵育的样品，以评估样本的自发荧光。
1.尽可能使环境样品均匀化，减少聚集对获得探针可接近的单细胞悬浮液的不利影响。在杂交之前通过离心分离细胞或洗涤环境样品。
2.不同细菌类别，选择不同固定方案。环境样品很可能含有革兰氏阴性和阳性细菌的混合物，有必要对革兰氏阴性和阳性细菌在杂交之前，可用两次不同方法固定。
（七）预杂交与杂交。
1.将固定细胞重新悬浮在500 µl FISH杂交溶液中，在37°C下培养30 min。完成后移除一份与预杂交混合物的（如50 µl）进行杂交。每个样品都能进行多次杂交，减少每个反应所需的探针。
2.混合物中加入荧光标记核苷酸探针。
探针浓度应根据经验决定。几个因素可影响所需探针数量：探针灵敏度、样品密度和杂交时间。根据经验，将5 µl 100 ng/µl探针加到50 µl预杂交液,中可产生一致且均匀的荧光。
3.在37°C至65°C避光处杂交或用铝箔覆盖试管孵育2-3 h。如使用多个探针，建议65℃下进行杂交。根据经验42°C，改变甲酰胺浓度，可以达到所需的杂交效果。
4.以13,000 g离心混合物5 min并丢弃上清液。
5.通过在20 µl 0.1X SSC中重新悬浮细胞颗粒以清洗细胞，37°C的黑暗中培养15 min。
6.以13,000 g离心混合物5 min并丢弃上清液。
7.重复步骤22-23两次。
8.在20 µl 0.1X SSC中重新悬浮洗涤过的细胞颗粒。
9.在载玻片上制备样品：
i. 将10 µl样品转移到用乙醇清洗过的显微镜载玻片上。
iv. 储存载玻片于黑暗中。在观察前可在4°C的黑暗中保存至多1 周。
10.通过流式检测，选择正确的流式激光的通道。
（七）实验问题：
1. 杂交温度：更低的温度会导致探针杂交增加，但也会降低特异性。
2.去离子甲酰胺浓度：可能需要低浓度的甲酰胺。一般情况下，0%-40%的甲酰胺寻找合适的范围浓度。
3.探针设计和浓度：探针设计自行设计标记或者联系我们，摩尔浓度0.5-5μM比较恰当，可能需要探针标记方法和探针的长度进行调整，长片段的探针可以稀释，短的浓度高一些。
4.洗涤步骤中使用的SSC浓度：使用1X SSC代替0.1X SSC将降低洗涤步骤的严密性。
5.洗涤温度：37°C通常被认为是最佳洗涤温度，5°C为增量或降低温度调整洗涤条件。
6.洗涤步骤的次数：减少洗涤步骤的次数会降低杂交的严密性。不建议少于两次的洗涤。
7.杂交混合物或制备的载玻片的储存条件：如果杂交混合物或制备的载玻片未在黑暗中储存或观察前的储存时间超过了建议的时长，则可能发生荧光降解。
8.探针没有与所需的细菌细胞特异性杂交。上述降低杂交严密性的因素可以调整，用严密的杂交反应。增加杂交和洗涤温度及洗涤步骤次数，将增加探针杂交的特异性和洗涤的严密性。杂交溶液的甲酰胺含量可以增加（不超过40%），调整，以确定理想杂交条件。
9.荧光信号过大或有光漂白现象。如果观察到过量荧光或出现光漂白，应考虑以下因素：1）细胞密度：在杂交反应中使用过多的细胞会使视场拥挤，难以观察到个体细胞。2）制备的载玻片的存放：制备好的载玻片应立即存放暗处，在观察中尽快拍图。
10.流式FISH的最大问题之一在于流式分析的设门，要考虑病毒、细胞、真菌的大小。
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