人源DNA残留检测试剂盒说明书

产品编号：006.9606      规格：100T

                                                     

应用范围

本试剂盒基于高度敏感的Taqman探针法，设计针对人基因组中高度重复序列设计引物及Taqman探针，可用于定量分析各种生物制品的中间品、半成品和成品中的人残留DNA含量，可检测出微量的DNA残留（10fg/ul）。

 

试剂盒组成

保存条件及有效期

       试剂盒在-20℃保存，有效期1年。

适用仪器

包括但不限于ABI系列、iCycler、Roche等基于Taqman技术原理设计的荧光检测仪及相应软件。

操作说明

1.Human DNA Control定量参考品的稀释及标准曲线的制备

 使用试剂盒提供的Nuclease-Free Water将Human DNA Control进行梯度稀释，稀释浓度依次为1ng/ul、100pg/ul、10pg/ul、1pg/ul、100fg/ul、10fg/ul；

1） 将Human DNA Control置于冰上完全融化，涡旋混匀，低速离心10s；

2） 取6支干净的1.5ml离心管，分别标记Std0、Std1、Std2、Std3、Std4、Std5；

3） 标记为Std0的管中加入90ul Nucelase-Free Water和10ul的Human DNA Control(10ng/ul)，涡旋混匀1min，此时Std0的浓度为1ng/ul，可置于-20℃保存，使用时避免反复冻融。

4） 在Std1、Std2、Std3、Std4、Std5管中加入90ul的Nucelase-Free Wate，再进行梯度稀释，具体稀释如下：

稀释管	稀释比例	浓度（fg/ul）
Std1	10ul Std0+90ul Nucelase-Free Wate，涡旋混匀1min	100000
Std2	10ul Std1+90ul Nucelase-Free Wate，涡旋混匀1min	10000
Std3	10ul Std2+90ul Nucelase-Free Wate，涡旋混匀1min	1000
Std4	10ul Std3+90ul Nucelase-Free Wate，涡旋混匀1min	100
Std5	10ul Std4+90ul Nucelase-Free Wate，涡旋混匀1min	10

2.反应体系

注：

a.   每个样本设置3个复孔，根据反应孔数配制Mix混合液总量：Mix混合液=（反应孔数+2）×（10+3）ul(含有2孔的损失量)

b.   阴性对照孔：Nucelase-Free Wate，待测样品孔：可做预实验确定大致浓度范围，如样本浓度高于标准曲线最高检测限，可用Nucelase-Free Wate进行稀释。

3.PCR扩增(FAM通道)

循环步骤	温度	时间	循环数
预变性	95℃	10min	1
变性	95℃	15s	50
退火	56℃	30s
延伸（收集荧光）	72℃	30s

 

结果分析

1.  标准曲线绘制；

以标准品的浓度C的对数为X轴，Ct值为Y轴作标准曲线，可使用Excel或ELISACalc软件计算。

 

示例：

      各标准品浓度对应的Ct值如下：

浓度（fg/ul）	10	100	1000	10000	100000
Ct	29.18	24.98	21.77	18.20	14.95

      以标准品的浓度C的对数lg(C)为X轴，Ct值为Y轴

Lg(C)	1	2	3	4	5
Ct	29.18	24.98	21.77	18.20	14.95

制作标准曲线，计算线性回归方程y=ax+b，R²

2.  待测样品浓度计算：

将待测样品浓度的Ct均值带入方程中，计算：

X_（待测）值=（Ct_(待测)-b）/a;

然后根据X值计算待测样品的浓度：

C_（待测）=10^( X_（待测）)×稀释倍数pg/ul

 

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