细菌原位杂交介绍之三-----不同标本类型的检测
1.培养后的细菌原位杂交：
（1） 细菌FISH探针的浓度为25-60μg/ml，即大约5-25μM浓度，杂交液稀释20-50倍。
（2） 将菌株震荡混合10秒，用钻石笔在玻璃上画圈，利用移液枪滴加50μL的细菌，并将载玻片置于37℃或室温干燥后1-24小时。
（3） 利用梯度乙醇浓度(50%，85%和95%)脱水，每次3分钟。在100%乙醇中脱水后，将载玻片风干，约1-60分钟。
（4） 杂交液稀释细菌探针（1:50）。取50μL探针溶液加在玻片上，加玻片，多出溶液用纸巾擦拭。放入孵育盒，然后盖好密封盖，避光48°C中杂交5小时或37℃过夜。
（5） 配置洗涤缓冲液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡30分钟。
（6） 再利用纯水浸泡10分钟，去除多余的盐分。每片加50μL 抗荧光淬灭剂DAPI，室温避光静置20分钟。荧光显微镜下，观察结果，拍照。
2.新鲜组织的细菌原位杂交：
（1） 取材新鲜活体组织，使用卡氏固定液，固定3-12小时。石蜡包埋，切片5-8μM。
（2） 二甲苯中浸泡2次，10分钟每次，在梯度乙醇50%，80%和95%中，按顺序脱水，每次3分钟，晾干标本，约1-2小时。
（3） 将杂交液与探针按照25:1稀释细菌探针。取50μL探针溶液加在玻片上，加玻片，纸巾擦拭干净。放入保湿孵育盒，封盖，避光48°C中杂交5小时，或37℃过夜。
备注：如果是陈旧标本需要使用细菌原位杂交试剂进行处理，如需要，请联系我们。
（4） 洗涤缓冲液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡30分钟。
（5） 再利用纯水浸泡10分钟，去除多余的盐分。每片加50μL 抗荧光淬灭剂DAPI，室温避光静置20分钟。观察结果。
（6） 在40倍或60倍或100倍荧光显微镜下观察，拍照。
3.血清和呕吐物的细菌原位杂交：
（7） 细菌FISH探针的浓度为25-60μg/ml，即大约5-25μM浓度，杂交液稀释20-50倍。
（8） 将血清或呕吐物，混合10秒，12000rpm，离心1分钟，用钻石笔在玻璃上画圈，利用移液枪滴加20-50μL的细菌，将载玻片置于56℃30min，或室温干燥1-24小时。
（9） 滴加梯度乙醇浓度(50%，85%和95%)脱水，每次1分钟。将载玻片风干，约20分钟。
（10） 杂交液稀释细菌探针（1:50）。取50μL探针滴液加到玻片，盖玻片覆盖，多出溶液用纸巾擦拭。放入孵育盒，然后盖好密封盖，避光56°C中杂交2小时或37℃过夜。
（11） 配置洗涤缓冲液(700mM NaCl 72 mL, 17mM Tris/HCl，0.1% SDS)，在46°C或37℃的水浴中浸泡10-30分钟。
（12） 再利用纯水浸泡10分钟，用手甩干。每片加50μL 抗荧光淬灭剂DAPI，室温避光静置20分钟。荧光显微镜下，观察结果，拍照。
4.流式细胞与核酸杂交技术结合----细菌检测
外显子生物专业提供荧光原位杂交探针多年，探针涵盖DNA、mRNA、miRNA、cicrRNA、LncRNA、nascent RNA、piRNA、细菌、真菌、寄生虫等原位杂交探针以及配套试剂盒和配套原位杂交检测设备。熟练应用各种核酸探针标记方法。
流式细胞术应用广泛，我们利用流式细胞术与FISH技术结合，对培养的细菌、血液微生物，血液培养、痰液、肺泡灌洗液、污染的食品痰进行探针杂交，然后进行流式分析，发现探针杂交后细菌能很好地应用于流式分析和分选出目的细菌，可以在感染血液、痰液等样品中快速检测和识别感染的种水平的微生物。与常规实验室方法PCR、测序、培养等技术。流式-FISH结合的方法，快速检测特定的细菌，初步试验还表明可以对细菌进行分选，检测常见感染10多种微生物，如肺炎克雷伯氏菌属肺炎克雷伯菌，链球菌、金黄色葡萄球菌，致病大肠杆菌等等，甚至还有一些真菌和部分寄生虫。
流式细胞技术应用于原位杂交，对标本处理要求不同，不需要用福尔马林固定，对标本是当处理，适合用于快速鉴别在各种肺部感染、败血症患者、肠道感染微生物检测，能达到属或种的水平检测。
流式细胞检测细菌实验步骤
（1） 血清、污水、呕吐物、牛奶等液体，适当的溶液处理，8000rpm，离心1分钟；
（2） 吸取上清20μL，加入配置好的核酸探针，85℃加热样品5分钟，60℃孵育30分钟；
（3） 流式细胞仪上机检测，流式务必做好对照。包括只含空白探针对照、单纯待检测样品对照、待检测样品对照。
（4） 结果分析，设门的时候需要，颗粒大小参考对照，荧光变化参考对照。
如果遇到更多问题，请联系我们。我们提供探针、试剂盒、耗材、设备等等。
联系电话：020-89895006 180 1199 7127 (24小时) E mail：focobio@126.com
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