石蜡切片样品制备
1. 将载玻片在干燥的烤箱中以,60 ℃烘烤 1-1.5小时，以提高玻片黏附。
2. 在通风橱中，将载玻片浸入二甲苯中 5 分钟，3次，对 FFPE 组织去石蜡处理。
3. 室温下将切片放入 100% 乙醇中孵育 2次， 2 分钟/次。中间上下移动切片1次。
4. 用纸巾将标本载玻片的边缘吸干。
5. 载玻片在室温下风干，不要太干（一般不超过20分钟）。
6. 在样品上加入 200 微升 30 µg/mL 蛋白酶 K 溶液，置于 37°C， 10 分钟。
注意：每批蛋白酶 K 的浓度和处理时间都应重新优化。
7. 将载玻片浸入纯水中，2次，2分钟/次。
8. 将载玻片边缘吸干，立即进行 HCR 检测。注意：不要让组织变干。

检测杂交
1. 在组织样本上加入 200 µL探针杂交缓冲液。
2. 在 37℃ 湿盒或杂交仪预杂交 10 分钟。湿盒或杂交仪如果没有，可联系我公司采购。
3. 准备探针溶液，在 100 µl探针杂交缓冲液中，各加入 0.5-1µl的探针1和探针2的混合物（外显子生物提供的是10µM探针）。即探针杂交缓冲液。注：可以采用更高浓度的探针以提高探针杂交效率，如各10pmol。
4. 去除预杂交溶液，用吸水纸吸干玻片边缘多余液。
5. 在组织样本上加入 50-100 µL探针溶液。
6. 将盖玻片放在样本上，置于湿盒或杂技仪中，在 37 ℃条件下过夜（12-16 小时）。
7. 将载玻片浸入 37℃ 的探针洗涤缓冲液中，盖玻片自然脱落。如没有洗涤容器，可联系我们采购。
8.用以下方法继续洗涤：最好在37℃条件下洗涤。
(a) 75% 的探针洗涤缓冲液/25% 的 5 SSCT，15 分钟
(b) 50% 的探针洗涤缓冲液/50%的 5 SSCT 15 分钟
(c) 25% 的探针洗涤缓冲液/75% 5 SSCT 15 分钟
(d) 100% 5 SSCT，15 分钟
9. 在室温下将载玻片浸入 5 SSCT 中 5-30 分钟。

信号放大（H1和H2信号放大探针）
1. 将载玻片边缘用纸巾吸干。
2. 在组织样本上加入 200 µL扩增缓冲液，孵育 30 分钟。
3. 分别制备 10 pmol 的H1 和 10 pmol 的 H2扩增溶液。一般探针为10µM加入1µL即10pmol。扩增液的体积一般50µL。
4．在 85 摄氏度下加热3分钟，避光放在室温 30 分钟复性。
千万注意：HCR 发夹 H1 和 H2是在不同的试管中快速冷却。
4. 将冷却的H1和H2 混合，即得到 100 µL室温下的扩增缓冲液中，制备发夹混合物。
5. 用力甩干玻片上的步骤9溶液
6. 在组织样本上加入 50-100 升发夹混合物。
7. 湿盒或杂交中孵育过夜（12-16 小时）。
8. 在室温下将载玻片放入 5 SSCT 中孵育，去除多余的发针：
洗涤1次 5 分钟，再洗涤2次 15 分钟，
9. 将载玻片边缘放在纸巾上擦干。
10. 在组织上加入 50-100 µL 放荧光淬灭DAPI片试剂。        

11. 将盖玻片放在上面进行显微镜观察。

欢迎使用我们的产品，有任何问题，请联系我们！

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