1. 试剂与材料的准备

二甲苯替代品

100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇

蒸馏水

PBS

蛋白酶消化液

变性液

洗液：2×SSC+0.1%NP-40

塑料玻片盒

Rubber Cement

盖玻片

DAPI-抗荧光淬灭封片剂

 2. 实验步骤

⑴ 石蜡切片（标本厚度约5μm）在烘箱中90℃1小时；

⑵ 浸入二甲苯替代品中，每缸5min；

⑶ 依次在100%乙醇、85%乙醇、70%乙醇中浸泡2min，

⑷ 将片子浸泡在蒸馏水中，煮30min；PBS浸泡，5min/次，2次

⑸ 将蛋白酶消化液预热至37℃；

⑹ 把片子浸泡在蛋白酶K消化液中，37℃消化5～25min；（隔5min左右，取出片子，观察消化情况）

⑺ PBS浸泡，5min/次，2次

⑻ 依次在70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇中浸泡1min，空气晾干；

⑼ 以下方法二选一：

玻片探针共变性

取10μl探针，滴加在标本上，盖上盖玻片，Rubber Cement封住盖玻片，杂交仪85℃变性8min；37-42℃杂交过夜。

玻片、探针分开变性

①将70%乙醇、85%乙醇、100%乙醇放入-20℃冰箱中，预冷；

②变性液水浴到77℃后，将片浸泡在其中，77℃4～6min；取出片子，立即将片子浸入预冷70%乙醇，1min，在依次将片子浸入85%乙醇、70%乙醇中，各1min；室温晾干（或用吹风机吹干，备用）；

③探针加入到0.2ml离心管，放入PCR仪中，95℃变性3min，37℃平衡2min；取10μl探针滴加在标本上，盖上盖玻片，Rubber Cement封片，42℃杂交，过夜；

⑽ 将一缸洗液预热至42℃;揭去凝固的Rubber Cement，将片子浸泡在常温的洗液中，待盖玻片自动脱落；再将片子放入72℃洗液中，5min；

⑾ 将片子移至常温洗液，浸泡5min；

⑿ 70%乙醇、100%乙醇脱水，晾干；

⒀ 滴加10μl 的DAPI-抗荧光淬灭封片剂，盖上盖玻片，15min后观察。

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