1. Xist探针准备

（1）在 Xist 序列获得寡核苷酸探针（20-40 核苷酸长度的寡核苷酸，Tm=63-65ºC，标记多个地高辛或荧光素），探针最终浓度约为12-25μM。亦可联系我们制备和购买探针，赠送内参。

（2）用杂交液将荧光或地高辛标记的探针稀释至终浓度为 250 nM 。杂交液配制：10%去离子甲酰胺，300mM NaCl；30mM柠檬酸钠；1mg/ml牛血清白蛋白；10% DSS。亦可联系我们购买。

2.制备石蜡组织切片或培养细胞：

石蜡组织切片：详见石蜡组织切片mRNA原位杂交，类似于普通免疫组化切片。培养细胞：移去 6 孔培养皿中培养基。用 PBS清洗，吸出，在培养皿中加入 0.5ml 胰蛋白酶，孵育5-10分钟。加入5 ml 培养基，打数分散细胞。将细胞转移到 10ml 管中，在室温下以 1500 rpm 离心5 分钟。弃去培养基，悬浮细胞于1-2 ml PBS中，细胞备用，福尔马林或无水乙醇固定10分钟。用细胞对切片进行涂片或用设备甩片，37℃晾干，过夜。

3. 免疫荧光

（1）将载玻片放入装有 PBSTT（1x PBS 含 0.1% Tween-20，0.1% Triton-100）的染色盒或染色缸内中10分钟。（2） 将载玻片倾斜放置，移去液体，滴加100 μl 封闭溶液（1x PBS、1% BSA、0.1% Tween-20），覆盖玻片，在室温下孵育 10 分钟。（3）取下盖玻片，倒去封闭液，加入 40-100μl 稀释抗体（浓度为 1:500， 荧光抗体），注意避光。盖好盖玻片，室温避光孵育30分钟。

3. 原位杂交

（1）将载玻片倾斜，抗体缓冲液顺玻片流下。在载玻片上加入 500 μl FISH 洗涤缓冲液（2x SSC+10% 甲酰胺），室温孵育5分钟。

（2）倾斜玻片，去除 FISH 洗涤液，载玻片上加入20μl 寡核苷酸探针，盖上盖玻片，然后将载玻片转移到预热的湿盒内；在37°C孵育 2-24 小时。

（3）玻片盒内加入 FISH 洗涤液，将洗涤液预热（如37°C水浴），FISH 洗涤缓冲液。载玻片孵育5分钟，期间，盖玻片从载玻片上脱落。

（4）更换洗涤液，将载玻片洗涤缓冲液中继续孵育 5 分钟。

（5）将载玻片滴加 0.5 ng/ml 含抗淬灭剂DAPI溶液（我公司有售）。

（6）用指甲油或甘油封片，荧光显微镜下观察、拍照。4°C避光中保存几个月。

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